Sistema de siembra de células rotativas esféricas para la producción de pequeños

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 3001 (2023) Citar este artículo

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Los vasos sanguíneos de ingeniería de tejidos humanos completamente biológicos (TEBV) se desarrollaron previamente para uso clínico. Los modelos de ingeniería de tejidos también han demostrado ser herramientas valiosas en el modelado de enfermedades. Además, existe la necesidad de TEBV de geometría compleja para el estudio de patologías vasculares multifactoriales, como los aneurismas intracraneales. El objetivo principal del trabajo informado en este artículo fue producir un TEBV de pequeño calibre ramificado completamente humano. El uso de un novedoso sistema de siembra de células rotatorias esféricas permite la siembra de células dinámicas uniformes y efectivas para un modelo viable de ingeniería de tejidos in vitro. En este informe se describe el diseño y la fabricación de un innovador sistema de siembra con rotación aleatoria esférica de 360°. Las cámaras de siembra hechas a medida se colocan dentro del sistema y sostienen andamios de polietilen tereftalato glicol (PETG) en forma de Y. Las condiciones de siembra, como la concentración de células, la velocidad de siembra y el tiempo de incubación, se optimizaron mediante el recuento de células adheridas a los andamios de PETG. Este método de siembra esférica se comparó con otros enfoques, como la siembra dinámica y estática, y muestra claramente una distribución celular uniforme en andamios de PETG. Con este sistema esférico fácil de usar, también se produjeron construcciones de TEBV ramificadas totalmente biológicas mediante la siembra de fibroblastos humanos directamente en mandriles de PETG de geometría compleja hechos a medida. La producción de TEBV de pequeño calibre derivados del paciente con geometría compleja y distribución celular optimizada a lo largo del vaso reconstruido puede ser una forma innovadora de modelar diversas enfermedades vasculares, como los aneurismas intracraneales.

El avance de los injertos vasculares de ingeniería tisular en los últimos años presenta una opción clínica prometedora para el tratamiento de enfermedades vasculares o para proporcionar modelos in vitro alternativos para estudiar estos trastornos complejos1,2. A través del refinamiento del modelo, ahora es posible producir vasos sanguíneos de ingeniería tisular derivados del paciente (TEBV) con antecedentes genéticos definidos para comprender mejor la patobiología detrás de las enfermedades vasculares3,4. A lo largo de los años se han desarrollado diferentes técnicas para generar TEBV, cada una de las cuales presenta pros y contras, y se pueden clasificar en tres categorías principales: (1) conductos vasculares hechos de células sembradas en andamios fabricados, (2) conductos vasculares hechos de láminas celulares ingeniería y (3) bioimpresión5,6. Sin embargo, uno de los desafíos en la ingeniería de tejidos vasculares sigue siendo mejorar la siembra, distribución y organización celular para incorporar células de manera homogénea en una estructura tubular. En consecuencia, las técnicas de siembra de células dinámicas se han establecido sobre enfoques estáticos más simples 7,8,9. Además, en un entorno tridimensional (3D), se necesita una distribución celular monitoreada uniformemente para fomentar la remodelación homogénea del tejido y evitar la competencia por los nutrientes en áreas con densidades celulares más altas10,11,12,13. El estado actual de la siembra celular dinámica permite una fácil producción de TEBV lineal con el uso de botellas rodantes y la siembra perfundida de células endoteliales en una construcción tubular. Sin embargo, estos no son ideales para la producción de TEBV tricapa de geometría más compleja compuesta por una adventicia, una media y una túnica íntima4,14,15,16.

Previamente, se ha demostrado que la producción de vasos sanguíneos lineales de pequeño calibre autoensamblados sembrados en polietilen tereftalato glicol (PETG) pretratados con rayos ultravioleta-C (UV-C) garantiza una unión celular adecuada y una secreción de matriz extracelular (ECM) optimizada. asamblea14. Para producir TEBV con geometría compleja y mejorar la siembra de células a lo largo de los andamios, desarrollamos un sistema rotatorio con un movimiento de rotación aleatorio que permite una distribución de células uniforme y eficaz. Describimos aquí el diseño y la fabricación de un innovador sistema de siembra rotatorio capaz de realizar una rotación completa de 360 ° y producir adventicia de vasos de ingeniería de tejidos ramificados completamente biológicos (TEBV-A).

Las especificaciones iniciales para la concepción de este novedoso sistema de siembra rotativa fueron una rotación de 360° con velocidad ajustable, un tiempo de operación de al menos 24 h y una capacidad de producción de un máximo de cinco TEBV simultáneamente. El diseño fue hecho para ser simple, directo y fácil de usar (Fig. 1A). Este modelo incluye una esfera acrílica hecha de dos mitades puestas en un movimiento de rotación esférico por dos motores en una placa de soporte para que se puedan producir TEBV dentro de las cámaras de siembra que se encuentran en el centro de la esfera (Fig. 1B-E). Este sistema de siembra ha sido adaptado para tener una rotación aleatoria de 360°. La rotación se considera aleatoria porque se utiliza la velocidad constante de los motores durante todo el tiempo de siembra y las imperfecciones en la forma de la esfera provocan cambios en el eje de movimiento (Video Suplementario 1). El sistema también tiene una velocidad ajustable de 63 a 135°/minuto, un tiempo de operación de más de 24 h y una capacidad de producción de cinco TEBV (Fig. 1F). También se puede colocar en un entorno con una temperatura controlable durante el paso de siembra.

Sistema de siembra rotativo. (A) Diseño asistido por computadora (CAD) del sistema con software CREO 5.0 con indicadores direccionales; (B,C) fotografías de las mitades macho y hembra de la esfera acrílica con anillo de cierre impreso en 3D y placas para mantener las cámaras de siembra en su lugar; (D) placa de soporte de aluminio con tres soportes tipo rodamiento de bolas, dos motores y una unidad de control electrónico; (E) cinco cámaras de siembra de células acrílicas hechas a medida; (F) sistema de siembra rotativo ensamblado. Barra de escala = 5 cm.

Se diseñaron cámaras de siembra personalizadas para sembrar células de fibroblastos humanos en andamios de PETG ramificados (Fig. 2). Las cámaras están compuestas por dos mitades de policarbonato con muescas en forma de Y mecanizadas a medida adecuadas para albergar andamios de PETG de 4,8 mm de diámetro en forma de Y (Fig. 2A-C). Estos andamios están hechos de tres partes separadas unidas por pasadores de acero inoxidable para que las diferentes ramas se puedan quitar para un fácil desmontaje. La mitad inferior tiene una junta tórica en forma de Y para hacer que la cámara sea hermética y la mitad superior tiene tres pequeñas aberturas que permiten agregar células y medios de cultivo (Fig. 2A). Las dos mitades se mantienen unidas con herrajes de acero inoxidable. Todas las piezas utilizadas para las cámaras se pueden esterilizar en autoclave y luego se utilizan bajo una campana biológica utilizando una técnica aséptica para sembrar células humanas (Fig. 2D). Se necesitan cinco de las cámaras de siembra cerradas para colocarse dentro del sistema rotatorio para que la esfera pueda funcionar correctamente (Fig. 2E).

Cámaras de siembra ramificadas a medida. (A) CAD del sistema con software CREO 5.0 de la mitad inferior de la cámara de siembra acrílica con muesca en forma de Y y junta tórica en forma de Y; (B) CAD de un andamio de PETG en forma de Y personalizado con pasadores de acero inoxidable; (C) CAD de la cámara de siembra completa cerrada con hardware y vista de pequeños tornillos para los puertos de siembra; (D) fotografía de todas las partes y hardware de las cámaras de siembra dentro de la campana biológica en un campo estéril; (E) fotografía de la cámara completa cerrada con hardware y vista de pequeños tornillos para el puerto de siembra. Barra de escala = 1 cm.

Para determinar los parámetros óptimos de siembra celular, primero probamos diferentes concentraciones celulares. Se utilizaron tres concentraciones celulares iniciales, indicadas aquí en millones de células por mililitro de medio de cultivo (M/mL), (0,1 M/mL, 0,15 M/mL y 0,30 M/mL) para sembrar las cámaras. Se permitió que las células se adhirieran a un mandril de PETG de 4,8 mm de diámetro durante un período de 22 horas a una velocidad media de 90°/min. A continuación, los mandriles sembrados con células se incubaron con tripsina durante 10 minutos y se contaron las células desprendidas. Se encontró que una concentración celular de 0,15 M/mL era el mejor parámetro de siembra celular (0,15 M/mL en comparación con 0,1 M, P < 0,0010; 0,15 M/mL en comparación con 0,3 M/mL, P = 0,3805) (Fig. 3A ). No se observaron diferencias significativas entre las condiciones para el número de células en el sobrenadante después de la siembra (Fig. 3A). Usando esta concentración celular óptima, queríamos determinar la mejor velocidad de siembra, es decir, la velocidad óptima para configurar el sistema de rotación esférica que permite que el número más significativo de células se adhiera al andamio. Se probaron tres velocidades de siembra diferentes (63°/min, 90°/min y 135°/min). Se encontró que el número de células adheridas al armazón de PETG era significativamente mayor cuando se usaba la velocidad de siembra de 90°/min de rango medio (63°/min en comparación con 90°/min; P = 0,0321 y 90°/min en comparación con 135° /min; P = 0,0119) (Fig. 3B). No se observaron diferencias significativas en el número de células en el sobrenadante después de la siembra de células (Fig. 3B). También se probaron diferentes tiempos de incubación después de la siembra de células dentro de las cámaras (4 h, 8 h, 16 h y 22 h). Se encontró que un tiempo de incubación de 22 h era el mejor parámetro aquí, ya que se adhirieron más células al andamio que cualquier otro tiempo de incubación probado (P < 0,0001). Además, se contaron más células en el sobrenadante después de 4 h de siembra en comparación con cualquier otro momento (P < 0,0001), lo que indica que las células no tuvieron tiempo de adherirse correctamente al andamio y todavía estaban en el medio de cultivo (Fig. 3C ). En general, los parámetros óptimos de siembra celular fueron 0,15 M/mL de células a una velocidad de 90°/min durante 22 h a 37 °C.

Número de células adheridas a los andamios y al sobrenadante en función de la concentración celular, la velocidad del sistema de siembra y el tiempo de incubación. (A) Se evaluaron tres concentraciones de células en millones de células por mililitro de medio (M/mL) sembrando células a 90°/minuto durante 22 h; (B) se evaluaron tres velocidades del sistema (°/min) sembrando células de 0,15 M/mL durante 22 h; (C) se analizaron cuatro tiempos de incubación (horas) sembrando 0,15 M/mL a 90°/min. Para los análisis estadísticos, se realizó un ANOVA de dos vías con la prueba de comparación múltiple de Tukey. El gráfico (A–C) muestra el cuadro y los bigotes con max y min. n = 4–5/grupo. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001. ns no significativo.

La nueva técnica de siembra esférica se comparó con un método de siembra dinámico y estático. En primer lugar, la distribución celular en andamios de PETG después de la siembra se puede observar con una tinción con azul de rodanilo (Fig. 4A). Se pueden observar distribuciones de células uniformes aparentes en los mandriles utilizando la técnica esférica en comparación con otras técnicas de siembra (Fig. 4A y Fig. 1 complementaria). Además, no se midió ninguna diferencia estadísticamente significativa entre la siembra esférica y las otras técnicas siguiendo los recuentos adecuados de células adheridas a los andamios después del período de siembra de 22 h (Fig. 4B). Sorprendentemente, TEBV-A, producido usando el sistema esférico descrito, superó estadísticamente a TEBV-A producido usando otras técnicas de siembra después de un período de maduración de 42 días de cultivo después de la siembra inicial (P < 0.05 y P < 0.0001) (Fig. 4C,D), lo que indica que una distribución uniforme puede ser importante para la producción de TEBV-A más grueso.

Distribución celular y viabilidad en TEBV-A post-sembrado y madurado producido por diferentes técnicas de siembra. (A) Fotografía de células teñidas con azul de rodanilo en andamio de PETG después de la siembra. Barra de escala = 1 cm; (B) número de células adheridas al andamio después de un período de siembra de 22 h; (C) espesores de tejido TEBV-A (µm) medidos después de un período de maduración de 42 días; (D) Tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de secciones histológicas recolectadas de TEBV-A madurado producido usando diferentes técnicas de siembra (esférica, dinámica y estática). Barra de escala = 100 µm; (E, F) Ensayo vivo/muerto en células cosechadas de TEBV-A post-sembradas analizadas por citometría de flujo; (G, H) Ensayo vivo/muerto en células cosechadas de TEBV-A maduras. (B,C) Caja y bigotes con max y min. Para los análisis estadísticos, se realizó una prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. n = 4–24. (F,H) Barras apiladas con desviación estándar. Para los análisis estadísticos, se realizó un ANOVA de dos vías con la prueba de comparación múltiple de Tukey. n = 5. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001. ns no significativo.

Otro aspecto importante a considerar aquí y comparar entre diferentes métodos de siembra es la viabilidad celular. Por lo tanto, se utilizaron ensayos vivos/muertos de citometría de flujo para cuantificar la viabilidad celular después de los períodos de siembra de 22 horas (possiembra) y de maduración de 42 días. Se encontró que la viabilidad posterior a la siembra era significativamente mayor cuando se usaba el sistema de siembra esférica en comparación con otros métodos de siembra; dinámico (P <0.001) y estático (P <0.001) (Fig. 4E, F y Fig. 2A complementaria). Aunque considerablemente más bajo, no se midió ninguna diferencia en la viabilidad celular, sin embargo, después del período de maduración posterior a la siembra de 42 días en cualquiera de las técnicas de siembra probadas (Fig. 4G, H y Fig. 2B complementaria). La menor viabilidad celular medida en TEBV-A maduro podría explicarse aquí simplemente por la digestión enzimática de 30 minutos necesaria para recolectar las células de la ECM para el análisis de citometría de flujo; este paso no es necesario en el período posterior a la siembra. En general, se midió una distribución celular más uniforme, un TEBV-A más grueso, así como una viabilidad celular mejorada utilizando el sistema giratorio esférico desarrollado en comparación con otras técnicas de siembra dinámica y estática.

Se produjeron TEBV-A completamente biológicos ramificados, fabricados con fibroblastos humanos, usando los parámetros óptimos de siembra de células predeterminados. Después de un período de incubación de siembra celular de 22 h, las cámaras de siembra se desmontaron del sistema. Los andamios sembrados con células se colocaron luego en placas de cultivo y se mantuvieron en cultivo durante 42 días. Los espesores de tejido se midieron usando un micrómetro láser en cada rama (Fig. 5A). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas para las tres ramas de los TEBV, lo que indica una distribución celular uniforme a lo largo de los mandriles sembrados (Fig. 5A, B). Para producir TEBV con una geometría compleja, como los andamios en forma de Y, era crucial diseñar un sistema de siembra de células que permitiera una distribución celular uniforme a lo largo de los andamios y, en particular, en el sitio de bifurcación/unión. Todos los TEBV-A ramificados mostraron células distribuidas uniformemente en el sitio de unión crítico macroscópicamente (Fig. 5C, D). Además, se midieron los espesores de tejido a partir de secciones transversales histológicas de las ramas y las uniones (Fig. 5E, F) y no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (Fig. 5G).

Caracterización macroscópica y microscópica del TEBV-A ramificado producido con el sistema de siembra rotativa desarrollado. (A) Fotografía de un TEBV-A de geometría "Y" en un andamio de PETG ramificado; (B) grosor del tejido de las tres ramas (I, II, III) de TEBV-A en µm. n = 4, n = 4; (C) fotografía de primer plano de la unión TEBV-A en el andamio (D) y cortada del andamio; (E) tinción con H&E de la rama y (F) unión de la muestra de TEBV-A cortada del andamio; (G) Grosor del tejido de las secciones histológicas de las ramas y la unión de TEBV-A en µm. n = 12. Las flechas muestran el sitio de unión. Para los análisis estadísticos, se realizó una prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn para el gráfico (B) y una prueba t de Welch para el gráfico (G). El gráfico (B,G) muestra un diagrama de dispersión con barras y desviación estándar. Barra de escala = 100 μm. ns no significativo.

En este artículo, logramos diseñar y construir un sistema de siembra de células esféricas giratorias capaz de producir TEBV biológicos de pequeño calibre con geometría compleja, hechos completamente de células humanas. Los parámetros de siembra celular se optimizaron para mejorar la distribución celular y la adherencia a lo largo de las áreas de andamiaje, incluso en el punto crítico de bifurcación/unión de los TEBV en forma de "Y" de prueba de concepto diseñados. En comparación con otros enfoques de siembra dinámicos y estáticos, nuestro novedoso método de siembra esférica permite que las células se distribuyan de manera más uniforme a lo largo del TEBV producido, demostró una mayor viabilidad celular posterior a la siembra y produjo tejidos más gruesos. El sistema descrito incluía cámaras de siembra mecanizadas a medida y fácilmente esterilizables que contenían andamios de PETG tratados con UV-C diseñados para encajar dentro de las cámaras de siembra. Cabe destacar que las cámaras de siembra se pueden rediseñar fácilmente con otras geometrías/especificaciones para ajustarse a diferentes formas, tamaños y ángulos de vasos sanguíneos en la bifurcación.

Se encontró que una concentración de células de 0,15 M/mL durante la siembra inicial de las cámaras, combinada con una rotación aleatoria en todas las direcciones (x, y y z) durante 22 horas a una velocidad de 90°/min, eran los parámetros de siembra óptimos. para favorecer la adherencia y distribución celular a lo largo del andamio PETG. Después del período de incubación de 22 h dentro de las cámaras de siembra, los andamios sembrados con células se retiraron de las cámaras y se cultivaron durante 42 días en medio de cultivo para promover la producción, ensamblaje y maduración de TEBV en ECM. La cinética de las interacciones entre células y andamios sólidos siguió el modelo de Langmuir, para el cual se adaptaron sus tres supuestos al cultivo celular: (i) las células no pueden adherirse para formar más que una monocapa; (ii) las células pueden adherirse a todas las superficies del andamio; (iii) las células pueden adherirse al andamio independientemente de las células ya adheridas hasta que se alcanza una monocapa17,18. Se sabe que el tratamiento UV-C de PETG promueve la adherencia celular al modificar los grupos carbonilo del plástico, lo que a su vez aumenta las propiedades hidrofílicas del material14,19,20,21. De acuerdo con la teoría de Langmuir, el movimiento de rotación del sistema de siembra dinámico descrito facilita las interacciones célula-andamio en toda la superficie del mandril de plástico tratado, lo que permite una mejor adherencia y distribución celular7,8,22. De hecho, el movimiento aleatorio de 360° de este novedoso sistema permitió que las células se encontraran con todas las partes del andamio de geometría compleja durante el período de siembra. Esto fue indicado por los espesores de tejido uniformes medidos a lo largo de las ramas del TEBV en forma de "Y". La tercera suposición de Langmuir implica que una vez que se alcanza una monocapa, las células dejan de unirse de forma independiente al andamio y comienzan a interactuar con otras células adheridas. Este aumento en las interacciones célula-célula a lo largo del tiempo puede haber promovido que las células se desprendan del andamio y explicar por qué se recuperaron iguales o menos células de PETG con una mayor densidad celular, alcanzando efectivamente una meseta17,21.

La velocidad media del sistema se consideró óptima para la siembra de células a 90°/min. Si bien todas las velocidades probadas fueron relativamente bajas, el sistema debía ser lo suficientemente rápido para mantener las células suspendidas en el medio durante toda la siembra, pero lo suficientemente lento para que las células interactuaran correctamente y se adhirieran al plástico. También se requirió un período de siembra más largo de 22 h para aumentar la unión celular. También se ha demostrado que las velocidades lentas durante períodos de tiempo más prolongados promueven una mejor unión celular en otros modelos23,24. Los parámetros de siembra celular, como la velocidad, la densidad celular y el tiempo, que dependen del tipo celular (interacción célula-armazón, adherencia celular, capacidad de producción de matriz), por lo tanto, deben optimizarse para cada modelo de ingeniería de tejidos y tipo de célula que se sembrará9 ,25,26,27,28. Estimamos la velocidad de sedimentación (V) dentro de las cámaras de siembra de 2,5 µm/s para la población de fibroblastos analizada, usando la Ley de Stokes en mecánica de fluidos V = (g(ρp − ρf)d2)/18μ calculada usando las siguientes constantes: ( gravedad (g: 9,81 m/s2), densidad celular (ρp: 1050 kg/m3), densidad del medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (ρf: 1007 kg/m3), diámetro de las células de fibroblastos (d: 10 µm) y viscosidad DMEM (μ: 0,00093 Pa·s) 29, 30. Aunque lenta, esta tasa de sedimentación de fibroblastos combinada con el movimiento de rotación aleatorio de la esfera durante 22 h permite una distribución celular uniforme en el andamio dentro de las cámaras de siembra giratorias, a pesar de la complejidad de la geometría30 ,31.

El uso de motores de escobillas, para hacer girar la esfera en un giro aleatorio de 360° a baja velocidad, está asociado a algunas limitaciones ya que ha llegado al máximo de su capacidad. La actualización a servomotores permitiría una rotación más precisa y eliminaría el riesgo de que los motores se detuvieran solos debido al sobrecalentamiento, el aumento de la resistencia y la disminución del voltaje. Este sistema de siembra de celdas rotativas utiliza un potenciómetro para regular el voltaje de los motores y dictar la velocidad de rotación. La adición de un sistema de microcontrolador y una pantalla electrónica permitiría un mejor ajuste de voltaje y una velocidad de rotación más precisa durante la siembra de células.

En comparación con otras técnicas de siembra, el método del sistema de siembra esférico desarrollado permitió una distribución celular uniforme en andamios de PETG, así como producir TEBV-A maduro más grueso después de 42 días de cultivo celular, independientemente de la cantidad de células adheridas inicialmente a los andamios durante el período de siembra. . Una distribución celular más uniforme puede entonces ayudar a la maduración del tejido y, en consecuencia, mejorar la secreción y el ensamblaje de la MEC32,33,34. Se ha demostrado que las interacciones célula-célula y célula-ECM en la ingeniería de tejidos son necesarias en el modelado de enfermedades para representar mejor la diafonía entre células, composiciones de tejidos y el microambiente asociado a patologías humanas complejas11,35,36.

Aunque el modelo TEBV completo incorpora una adventicia (fibroblastos), medios (células de músculo liso) y túnica íntima (células endoteliales), el estado actual de los modelos TEBV ramificados está evolucionando rápidamente de prótesis vasculares ramificadas a stents vasculares ramificados en la clínica a tubos de colágeno ramificados. con células endoteliales e injertos vasculares ramificados impresos en 3D4,37,38,39. Hasta donde sabemos, somos el primer equipo de investigación en producir un modelo de TEBV ramificado de pequeño calibre completamente biológico de la adventicia sin material exógeno. De particular interés, el sitio de la unión crítica permaneció intacto y no se rasgó después del desmontaje del andamio. Este innovador sistema hace posible la producción de tejidos con un grosor suficiente que permita su manipulación, observación y estudio con una sola hoja de fibroblastos monocapa, aunque todavía no se puede perfundir. Múltiples siembras de células secuenciales podrían ser el siguiente paso apropiado para hacer TEBVs40 multicapa más gruesos.

La producción de TEBV de pequeño calibre derivados del paciente con geometría compleja puede ser una forma innovadora de modelar diversas enfermedades vasculares. Por ejemplo, los TEBV en forma de Y construidos serían un modelo in vitro único para estudiar aneurismas intracraneales (IA), que ocurren principalmente en las bifurcaciones del círculo de Willis en individuos afectados41,42. La AI es un trastorno cerebrovascular en el que la debilidad de la pared de los vasos sanguíneos cerebrales provoca un abombamiento localizado43. Los IA presentan una tasa de mortalidad del 50% y una tasa de morbilidad de los supervivientes del 30-50%, tras su rotura44. El uso de TEBVs en forma de Y cultivados en un biorreactor que permitan generar un flujo sanguíneo artificial pero fisiológico será de particular interés en el estudio de la IA y la hemodinámica. Dado que el componente genético de los IA aún no se comprende muy bien, los TEBV multicapa y ramificados derivados de pacientes para producir vasos sanguíneos completamente reconstituidos con íntima, media y adventicia también serían de gran interés para el estudio de los mecanismos asociados a los IA patogénicos y fisiopatológicos.

En conclusión, presentamos un innovador sistema de siembra de células rotativas, fácil de usar, lavable y esterilizable, que permite producir cinco TEBV tubulares de pequeño calibre de la adventicia con una geometría compleja. En general, el sistema de siembra y las cámaras fueron conceptualizados y hechos a la medida para que su operación sea simple. Por lo tanto, el sistema descrito tendrá impactos considerables para futuras investigaciones considerando que las células distribuidas uniformemente a lo largo de los andamios durante la siembra de células es crucial para la ingeniería de tejidos y cultivo 3D.

Se utilizó el software CREO 5.0 (PTC, Boston, MA, EE. UU.) para producir CAD para el sistema de siembra antes de la construcción (Fig. 1A). La esfera se fabricó con dos mitades de una esfera hueca acrílica de 10 pulgadas de diámetro (California Quality Plastics, Ontario, CA, EE. UU.) (Fig. 1B,C). Se fabricaron dos anillos de cierre impresos en 3D con filamento PETG de 1,75 mm (Filaments.ca, Mississauga, ON, Canadá), impresos en una impresora 3D H800 (Afinia, Chanhassen, Min, EE. UU.) y pegados a las mitades de la esfera con Silastic™ medical. elastómero de grado (Dupont, Wilmington, NC, EE. UU.). Los anillos de cierre se mantienen unidos mediante tornillos de cabeza hexagonal de acero inoxidable (McMaster-Carr, Chicago, IL, EE. UU.) atornillados en el anillo PETG macho y bloqueados en el anillo PETG hembra. Las placas impresas en 3D se conceptualizaron e imprimieron como se describió anteriormente para mantener en su lugar las cámaras de siembra. Las placas se unieron a la esfera con soportes impresos en 3D que se pegaron al centro de la mitad de la esfera con Silastic™. Para garantizar que las cámaras de siembra permanezcan en su lugar mientras el sistema gira, se agregó presión a través de resortes resistentes a la corrosión de acero inoxidable (McMaster-Carr). La placa de soporte se fabricó con una aleación de aluminio 6061-T6 (Acier Picard, Levis, QC, Canadá) utilizando una fresadora de 3 ejes (Fryer Machine Systems, Patterson, NY, EE. UU.) (Fig. 1d). Dos motores de escobillas de CC de 12 V, 10 RPM (RobotShop, Mirabel, QC, Canadá) se colocaron perpendicularmente entre sí para proporcionar el movimiento de rotación del sistema. Dos soportes de motor y tres soportes de aluminio tipo rodamiento de bolas fueron hechos a la medida y fijados a la placa. Se colocaron bolas de acero inoxidable resistentes a la corrosión dentro de los cojinetes de soporte para garantizar la rotación adecuada de la esfera y ofrecer soporte adicional (McMaster-Carr). Los componentes electrónicos para suministrar corriente y controlar la velocidad se colocaron dentro de una caja PETG impresa en 3D. Los motores se conectaron a interruptores separados de 3 posiciones, potenciómetro de 25 k, un regulador de voltaje lineal (Digi-Key, Thief River Falls, Min, EE. UU.) y una fuente de alimentación de 5 V CA/CC de grado médico (Newark, Mississauga, ON, Canadá ) que se enchufa en un tomacorriente de pared normal de 125 V. Todas las fotografías y videos se tomaron con la mini cámara del iPhone 12 (Apple, Cupertino, CA, EE. UU.).

También se utilizó el software CREO 5.0 (PTC) para producir CAD para las cámaras de siembra (Fig. 2A–C). Las cámaras consistían en dos mitades distintas de policarbonato hechas a medida (Groupe PolyAlto, Quebec, QC, CA). Se cortaron muescas en forma de Y en ambas mitades usando la máquina fresadora de tres ejes (Fryer Machine Systems). La mitad inferior estaba rodeada por una junta tórica de silicona blanda de alta temperatura en forma de Y, 3/32 de ancho fraccional (McMaster-Carr) para sellar las mitades de la cámara de siembra entre sí (Fig. 2D). La mitad superior se hizo con tres aberturas que sirven como puertos de siembra sellados con juntas tóricas de silicona blanda para alta temperatura, 3/64 de ancho fraccional y tornillos de fijación de punta cónica de acero inoxidable 18-8, rosca M4 × 0,7 mm, 4 mm de largo (McMaster-Carr). Los andamios desmontables en forma de Y fueron cortados a la medida con una fresadora de 5 ejes (Fryer Machine Systems, Patterson, NY, EE. pasadores, 1/32" de diámetro, 1/4" de largo (McMaster-Carr). Estos andamios se colocan en el centro de las cámaras de siembra, dentro de la hendidura en forma de Y, y las dos mitades se unen y se cierran por completo con tornillos hexagonales de cabeza semiesférica de acero inoxidable 316, rosca M4 × 0,7 mm, 16 mm de largo con arandelas de acero inoxidable 316 de uso general para tamaño de tornillo M4, 4300 mm de DI, 8 mm de DE y tuercas hexagonales de acero inoxidable 316, superresistentes a la corrosión, rosca M4 × 0,7 mm (McMaster-Carr) (Fig. 2E). Todas las fotografías fueron tomadas a través de la mini cámara del iPhone 12 (Apple).

Se aislaron fibroblastos dérmicos humanos como se describió anteriormente45 y se cultivaron en DMEM (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) que contenía suero bovino fetal al 10 % (FBS; VWR, Radnor, PA, EE. UU.), 100 UI/mL de penicilina G y 25 μg/mL gentamicina (Sigma-Aldrich, Kawasaki, OL, Japón). El uso de células humanas fue aprobado por la junta de investigación ética de la CHU de Quebec (Número de protocolo: 1115C y 1115D) y el individuo fue reclutado de forma voluntaria tras el consentimiento informado. Las células se sembraron con 10 ml de medio de cultivo DMEM en las cámaras que contenían varillas de PETG tratadas con UV-C de 4,8 mm de diámetro (McMaster-Carr). Las cámaras de siembra se colocaron en el sistema de siembra rotatorio y se mantuvieron a 37 °C para los experimentos posteriores. El tratamiento con UV-C se realizó como se describió anteriormente durante 30 min/lado (giro de 90°) y luego se recubrió con gelatina al 0,2 % (Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.)14. Para determinar la concentración celular óptima para usar durante la siembra inicial, se probaron tres condiciones (0.10, 0.15 y 0.30 M/mL) y se agregaron a las cámaras celulares, luego se colocaron en el sistema rotatorio a velocidad media durante 22 h. También se probaron tres velocidades de rotación diferentes para optimizar mejor los parámetros de siembra celular. Las cámaras se sembraron con fibroblastos (0,15 M/mL), se instalaron en la esfera giratoria durante 22 h a una velocidad de rotación de 63°, 90° o 135°/minuto, estas velocidades se consideraron como la mínima, mediana y máxima alcanzable. por la esfera. También se probaron diferentes períodos de incubación después de la siembra de células. Las cámaras de siembra se sembraron con fibroblastos (0.15 M/mL), colocados en la esfera a una velocidad de rotación de 90°/minuto durante 4, 8, 16 y 22 h.

Los sobrenadantes se recuperaron y centrifugaron a 300 xg durante 10 min al final de cada uno de estos tiempos de incubación. Las células restantes no adheridas y centrifugadas presentes en los sobrenadantes se resuspendieron en 1 ml de medio DMEM y se contaron usando un contador de células (Beckman Coulter, Pasadena, CA, EE. UU.). Las varillas de PETG sembradas con células o los andamios en forma de Y se incubaron primero con tripsina al 0,05 % (Fisher Scientific)/EDTA al 0,01 % (Teknisciences, Terrebonne, QC, Canadá) durante 10 minutos para permitir que las células se separen y luego se centrifugaron a 300 × g. durante 10 min. Las células recuperadas se resuspendieron en 1 ml de medio y luego se contaron mediante un contador de células Coulter (Beckman Coulter).

Se cultivaron fibroblastos dérmicos humanos en medio DMEM con FBS al 10 % y el cóctel de antibióticos. Se sembraron células de 0,15 M/mL en cámaras de siembra hechas a medida a través de los orificios de siembra. Se inyectó un total de 10 ml de medio de cultivo DMEM en las cámaras de siembra que contenían andamios en forma de Y fabricados con varillas de PETG de 4,8 mm de diámetro (McMaster-Carr). Los andamios de PETG se pretrataron con UV-C y luego se recubrieron con gelatina al 0,2 % (Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) como se describió anteriormente14. Para la siembra esférica, las cámaras sembradas se colocaron en la esfera a 90 °/minuto durante 22 h en una habitación a 37 °C. Para la siembra dinámica, las cámaras sembradas se colocaron en un agitador orbital (BlotBoy, Benchmark Scientific, Sayreville, NJ, EE. UU.) durante 22 h en una incubadora a 37 °C y CO2 al 8 %. Para la siembra estática, las cámaras se colocaron directamente en una incubadora de CO2 al 8 % a 37 °C durante el período de siembra de 22 h. A continuación, los andamios sembrados con células se recuperaron y se colocaron en una placa de cultivo celular de 500 cm2 que contenía medio de cultivo DMEM, complementado con 50 μg/mL de ácido ascórbico (Sigma), durante 42 días en una incubadora a 37 °C y CO2 al 8 %. El medio se cambió cada 2 o 3 días y los andamios se giraron 180° cada día de cambio de medio de cultivo.

Se tomaron imágenes macroscópicas de andamios de PETG en forma de Y sembrados con células con la mini cámara del iPhone 12 (Apple). Los espesores de tejido en las tres ramas diferentes del andamio en forma de Y se midieron con un micrómetro láser de alta precisión (Keyence, Mississauga, ON, Canadá). Se utilizaron cuatro mediciones diferentes en cada una de las ramas de cuatro TEBV en forma de Y diferentes para el análisis estadístico. Los TEBV se fijaron en formalina al 3,7% durante la noche (ChapTec, Montreal, QC, Canadá). También se tomaron fotografías macroscópicas de los sitios de unión de los TEBV biopsiados antes del análisis histológico. Las secciones transversales de TEBV fijadas de 10 μm se tiñeron luego con hematoxilina y eosina (H&E) como se describió previamente36. Las imágenes microscópicas se adquirieron y midieron en condiciones de campo claro utilizando un microscopio vertical (AxioImager.M2; Carl Zeiss Microscopy, Jena, TH, Alemania). Para el análisis de distribución, los andamios sembrados se fijaron en formalina al 3,7 % durante 30 min, luego se colocaron en tinción con azul de rodanilo durante 15 min, luego se enjuagaron antes de dejar secar antes de tomar fotografías macroscópicas de todos los lados del andamio.

Después de los períodos de siembra de 22 h, se recuperaron los sobrenadantes y se centrifugaron a 300 × g durante 10 min para cada técnica de siembra. Los bastones de PETG sembrados con células se incubaron con tripsina al 0,05 % (Fisher Scientific)/EDTA al 0,01 % (Teknisciences) durante 10 min para permitir que las células se separaran y luego se centrifugaron a 300 xg durante 10 min. Las células recuperadas del sobrenadante y los andamios se incubaron durante 15 min con Calcein AM 2,5 nM (Thermo-Fisher) para marcar las células vivas y Ethidium homodimer-1 4 μM (Thermo-Fisher) para marcar las muertas. Las células se analizaron inmediatamente con un citómetro de flujo BD FACSMelody™ (BD Biosciences) y los datos se trataron con el software FlowJo™ v9 (Ashland, OR, EE. UU.). Para los tejidos maduros, primero se recuperaron de los andamios y se colocaron en una solución de digestión de 5,7 U/ml de colagenasa H (Sigma-Aldrich) en accutasa (Sigma-Aldrich) a 37 °C con agitación de 300 rpm durante 30 min. Las células se filtraron a través de un filtro de células de 40 μm (Fisher Scientific) y se centrifugaron a 300 xg durante 10 min. Finalmente, las células se analizaron como se describe a continuación.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 9.0 (GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.). Los datos presentados en gráficos de caja y bigotes con máximo y mínimo se analizaron mediante ANOVA de dos vías con la prueba de comparación múltiple de Tukey o mediante la prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. Los datos presentados en diagrama de dispersión con media y desviación estándar (DE) se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn o mediante la prueba t de Welch. Los datos presentados por barras apiladas con SD se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. Un valor P de < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

El estudio fue aprobado por nuestros Comités de Ética Institucional (Consejo de Ética en Investigación del CHU de Québec; número de protocolo 1115 C y 1115 D. Para obtener más información, comuníquese con ([email protected]). Todos los experimentos se realizaron de conformidad con las Directrices de política del Tri-Council nacional: Conducta ética para la investigación con seres humanos y aprobadas por el comité de ética de la CHU de Quebec—Université Laval.

Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos involucrados de forma voluntaria en el estudio.

Los datos presentados en este estudio están disponibles previa solicitud al autor correspondiente.

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Nos gustaría agradecer a Marc-André Campagna, André Chamberland, Patrick Dupuis, Frédéric Morin y Pierre Carrier del taller de ingeniería mecánica de la Universidad Laval. Nos gustaría agradecer a Todd Galbraith, Vincent Clement, Isabella Bienjonetti y Richard Brodeur por su asistencia técnica y valiosos consejos.

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del New Frontiers in Research Fund (NFRF) y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR). JR es un destinatario de la NFRF. FG-L. es el destinatario de las Cátedras de Investigación de Canadá. VR recibió una beca de doctorado del Fonds de la Recherche du Quebec en Santé (FRQS).

Departamento de Cirugía, Facultad de Medicina, Universidad Laval, Ciudad de Quebec, QC, Canadá

Alyssa Brodeur, Vincent Roy, Lydia Touzel Deschênes y François Gros-Louis

División de Medicina Regenerativa, Centro de Investigación CHU de Quebec, Universidad Laval, Ciudad de Quebec, QC, Canadá

Alyssa Brodeur, Vincent Roy, Lydia Touzel Deschênes, François Gros-Louis y Jean Ruel

Departamento de Ingeniería Mecánica, Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad Laval, Ciudad de Quebec, QC, Canadá

Alexandre Winter y Jean Ruel

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Conceptualización, AB, AW, VR, FG-L. y JR; metodología, AB, AW, VR, LT-D., FG-L. y JR; software, AB y AW; validación, VR, FG-L. y JR; análisis formal, AB y VR; investigación, AB, AW y LT-D.; recursos, LT-D., FG-L. y JR; curación de datos, AB y AW; redacción—preparación del borrador original, AB; redacción: revisión y edición, AB, AW, VR, FG-L. y JR; visualización, AB y VR; supervisión, VR, FG-L. y JR; administración de proyectos, FG-L. y JR; adquisición de fondos, FG-L. y JR Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Jean Ruel.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Brodeur, A., Winter, A., Roy, V. et al. Sistema de siembra de células rotatorias esféricas para la producción de vasos sanguíneos de ingeniería tisular de pequeño calibre con geometría compleja. Informe científico 13, 3001 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29825-0

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Recibido: 08 Septiembre 2022

Aceptado: 10 febrero 2023

Publicado: 21 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29825-0

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