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Nature Biomedical Engineering (2023)Citar este artículo

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Las vacunas contra el cáncer deben activar múltiples tipos de células inmunitarias para que sean eficaces contra los tumores agresivos. Aquí informamos el impacto de la presentación estructural de dos péptidos antigénicos en las respuestas inmunes a nivel transcriptómico, celular y del organismo. Utilizamos nanopartículas de ácido nucleico esférico (SNA) para investigar cómo la distribución espacial y la ubicación de dos clases de antígenos afectan el procesamiento de antígenos, la producción de citoquinas y la inducción de la memoria. En comparación con los SNA de antígeno único, un SNA de antígeno dual único provocó un aumento del 30% en la activación de células T específicas de antígeno y un aumento del doble en la proliferación de células T. La ubicación del antígeno dentro de los SNA de antígeno dual alteró la expresión génica de las células T y el crecimiento tumoral. Específicamente, los SNA de antígeno dual que encapsulan antígenos dirigidos a las células T auxiliares y con antígenos conjugados externamente dirigidos a las células T citotóxicas elevaron las vías genéticas antitumorales, lo que detuvo los tumores de linfoma en ratones. Además, cuando se combinó con el inhibidor de punto de control anti-proteína 1 de muerte celular programada en un modelo de ratón de melanoma, una disposición de antígeno específica dentro de SNA de antígeno dual suprimió el crecimiento tumoral y aumentó los niveles de células T de memoria circulantes. El diseño estructural de las vacunas multiantígenas afecta sustancialmente su eficacia.

La vacunación es una estrategia atractiva contra los cánceres que expresan antígenos y neoantígenos asociados a tumores dirigibles. Para el melanoma, se han realizado esfuerzos cada vez mayores para desarrollar vacunas dirigidas a proteínas asociadas a tumores identificadas (por ejemplo, gp100, MAGE-A3, MART-1 y NY-ESO-1)1,2,3,4. Sin embargo, aunque estas vacunas obtienen algunos beneficios (como el aumento de las células T específicas de melanoma activadas), muchas están diseñadas para activar principalmente las células T citotóxicas. Los tumores pueden tener una heterogeneidad considerable y cargas mutacionales altas5,6 que permiten escapar fácilmente de la vigilancia inmunológica7. Por lo tanto, las vacunas que dependen principalmente de la actividad de las células T citotóxicas son inadecuadas y requieren vacunas que contengan antígenos dirigidos a múltiples tipos de células inmunitarias para inducir una mayor remisión del tumor.

Los enfoques comunes para provocar una respuesta inmunitaria multifacética incluyen la administración de "péptidos largos" cuya secuencia cubre múltiples epítopos para activar las células T citotóxicas y auxiliares, o de múltiples antígenos peptídicos "mínimos", cada uno exclusivo de las subclases de células T8,9, 10,11. Sin embargo, muchos de estos esfuerzos en curso involucran grupos de péptidos, con o sin adyuvante, administrados en solución salina como una mezcla. Recientemente, simples cambios en la administración de componentes de vacunas utilizando enlaces químicos básicos12 o nanotecnología13,14,15,16 han demostrado el potencial de estructurar vacunas para mejorar la potencia. Este concepto, denominado 'vacunología racional', ofrece un camino para optimizar estructuralmente la colocación de antígenos dirigidos a múltiples tipos de células inmunitarias dentro de una vacuna para una amplia inmunidad antitumoral.

En este trabajo, exploramos el espacio de diseño de vacunas que involucra múltiples antígenos dirigidos a células. Al emplear cambios estructurales en la colocación de antígenos, dilucidamos el impacto de la respuesta inmunitaria resultante y la aprovechamos para impulsar el éxito en los esfuerzos de traducción. Los antígenos utilizan linfocitos T citotóxicos (CD8+) activados para matar tumores de forma eficaz, así como linfocitos T auxiliares (CD4+) para crear sinergias en las interacciones inmunitarias para un rechazo tumoral duradero17,18. Las células T CD4+ mantienen la funcionalidad CD8+ dirigida por el tumor al reclutarlas en el sitio del tumor y mejorar su proliferación y funciones efectoras19,20,21,22,23. Por lo tanto, las vacunas en este trabajo consideran la ubicación estructural precisa de los objetivos de antígenos tanto del complejo principal de histocompatibilidad (MHC)-I-restringido como del MHC-II (activadores de CD8+ y CD4+, respectivamente) para preparar el sistema inmunitario de la manera más eficaz. .

Aquí usamos la plataforma de ácido nucleico esférico (SNA) para dilucidar el efecto de la estructura a nanoescala en los procesos inmunológicos de múltiples antígenos. El SNA comprende un núcleo de nanopartículas (como un liposoma) con una superficie de oligonucleótidos densa y dispuesta radialmente. Los SNA son herramientas poderosas para explorar estas relaciones complejas debido a su biocompatibilidad24, la capacidad de ingresar rápidamente a las células en grandes cantidades25,26, su potente activación inmunitaria cuando se emplea ADN agonista del receptor tipo toll 9 (TLR9) como la cubierta27 y su modularidad, que permite la colocación definida a nanoescala de componentes usando química bien conocida28,29,30. En este trabajo, mostramos cómo la estructura de las vacunas SNA que llevan múltiples antígenos peptídicos dirigidos a células inmunitarias influye en gran medida en la activación inmunitaria. Cambiar la posición del tipo de antígeno dentro del SNA altera el procesamiento de las células dendríticas, regula al alza las vías de las células inmunitarias a nivel del transcriptoma, mejora la producción y secreción de citoquinas y marcadores de memoria a nivel celular y ralentiza el crecimiento tumoral a nivel del organismo. En conjunto, estos cambios definen la potencia de la vacuna contra un modelo agresivo de tumor de melanoma B16-F10 y, lo que es más importante, aclaran las ideas de diseño con respecto a la ubicación de múltiples antígenos peptídicos que pueden traducirse en otras terapias y guiar su desarrollo.

Intentamos determinar las condiciones óptimas de procesamiento de antígenos para las vacunas SNA de múltiples antígenos para generar respuestas robustas de células T auxiliares y citotóxicas. En particular, investigamos cómo la entrega de péptidos para dos clases de antígenos (restringido por MHC-I y restringido por MHC-II) a las células dendríticas (DC) cambiaría el procesamiento in vitro. Las DC son células presentadoras de antígeno profesionales críticas que inducen la señalización para el cebado efectivo de las células T. Trabajos previos han demostrado el potencial para mejorar la activación de DC a través de la entrega simultánea de antígenos citotóxicos y auxiliares31,32, pero ninguno ha tenido un sistema capaz de comprender la mejor manera de presentar tales antígenos. Presumimos que la entrega simultánea de ambas clases de antígenos en la misma nanopartícula, a diferencia de su entrega en diferentes nanopartículas, mejora la activación de ambos tipos de células T, y que la ubicación estructural de los antígenos afecta notablemente el rendimiento de la vacuna.

Para probar esta hipótesis, diseñamos y sintetizamos vacunas SNA de antígeno dual (DA-SNA) que contenían antígenos restringidos tanto por MHC-I como por MHC-II en diferentes ubicaciones a nanoescala (denominadas DA-SNA 1 y DA-SNA 2, basado en la ubicación de cada antígeno, Fig. 1a). Debido a la modularidad de los SNA, existen múltiples ubicaciones diferentes dentro de la construcción de SNA donde se pueden colocar los antígenos. Para este trabajo, se seleccionaron arreglos de encapsulación e hibridación para la colocación de antígenos y se compararon entre sí. Para evaluar cómo la distribución de antígenos y la entrega en diferentes nanopartículas afectan la activación inmunológica, se sintetizaron formulaciones que contenían dos SNA individuales, cada una de las cuales presentaba solo una clase de antígeno en la misma posición que en la vacuna DA-SNA (Figura complementaria 1). Las formulaciones se denominaron 'separadas' para los SNA individuales que administraban un solo antígeno y 'combinadas' para el DA-SNA que contenía antígeno dual.

a, Vacunas SNA de antígeno dual (DA-SNA) sintetizadas para alterar la colocación de antígenos restringidos por MHC-I y MHC-II dentro de la misma estructura de nanopartículas. b, La expresión (medida a través de MFI) de los marcadores coestimuladores CD80 (izquierda) y CD86 (derecha) en las DC CD11c+ según la administración de las dos clases de antígenos en nanopartículas separadas (discontinuas, separadas) o en un DA-SNA singular ( sólido, combinado). c, linfocitos T CD8+ específicos para el antígeno OVA1 (izquierda) o linfocitos T CD4+ específicos para el antígeno OVA2 (derecha) generados a partir de un cocultivo de DC pulsadas con tratamiento con linfocitos T esplénicos vírgenes. d, MFI de la señal del marcador de activación de CD69 dentro de la población de células T CD8+ específicas de antígeno (izquierda) o CD4+ (derecha). e, Cambio de veces en la proliferación de células T a partir de esplenocitos OT1 específicos para el antígeno OVA1 después del cocultivo con CD pulsadas de tratamiento. Para todos los paneles, se muestra la media ± sem, junto con la significación estadística entre las comparaciones relevantes. La significación se calculó utilizando un ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak, con n = 3–4 repeticiones por grupo. NS, no significativo.

Para sintetizar DA-SNA, se encapsuló un péptido de una clase de antígeno en liposomas de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) de 50 nm durante su formación (Figs. 2 y 3 complementarias). Paralelamente, el péptido de la otra clase de antígeno se conjugó con una hebra complementaria a la cubierta de ADN adyuvante del motivo CpG ("complemento CpG") del SNA mediante la formación de enlaces disulfuro (Fig. 4 complementaria). Las secuencias de ADN y péptidos utilizadas en este trabajo se pueden encontrar en las Tablas complementarias 1 y 2. Se formó un dúplex hibridado enfriando lentamente el complemento CpG con un antígeno adjunto a una cadena CpG complementaria terminada en 3'-colesterol. El resto de colesterol ancla el dúplex a la superficie del liposoma. Se ha demostrado previamente que estas dos hebras se duplican efectivamente a temperaturas por debajo de ~56 °C33,34. Este producto hibridado se añadió a los liposomas para obtener una cantidad equimolar de cada antígeno. La superficie del liposoma se rellenó con ADN T20 no dirigido que no contenía antígeno para obtener 75 cadenas de ADN totales por liposoma, equivalente a una densidad de 1,6 pmol cm−2 a la que se observan propiedades asociadas con los SNA que los hacen útiles en biología16. Los SNA que contenían un solo antígeno encapsulado o un solo antígeno hibridado (las formulaciones 'separadas') se sintetizaron siguiendo los protocolos anteriores16. La formación de SNA se confirmó mediante dispersión de luz dinámica (Fig. 5 complementaria), y la estabilidad de las nanoestructuras se mantuvo durante 45 días (Fig. 6 complementaria).

Una vez que se sintetizaron estas diferentes estructuras, se evaluó su capacidad para cebar las CD mediante el uso de antígenos modelo de ovoalbúmina (OVA) restringidos por MHC-I y restringidos por MHC-II, conocidos como OVA1 y OVA2, respectivamente. La activación de las señales de DC y la capacidad de cebar las células T se caracterizaron utilizando DC derivadas de médula ósea murina (BMDC) y antígenos administrados como dos estructuras SNA separadas frente a la vacuna combinada DA-SNA. Una incubación durante la noche de BMDC con los diferentes arreglos estructurales de la vacuna mostró que el porcentaje de CD11c + DC que expresan marcadores de coestimulación innatos CD86 y CD80 no cambió significativamente (Fig. 7 complementaria). Esto probablemente se atribuya al hecho de que una incubación prolongada puede conducir a niveles equivalentes de suministro de adyuvante entre las formulaciones combinadas y separadas e indica que la hibridación con CpG no interfiere con la activación de TLR9. Para maximizar las diferencias y evaluar el impacto de la cinética temprana en la actividad inmunoestimuladora y la expresión de los marcadores coestimuladores, pulsamos DC con las diversas formulaciones estructurales durante 30 min y reemplazamos los medios antes de permitir que las DC expresen señales coestimuladoras. Los resultados (Fig. 1b) ilustran que la disposición de antígenos con OVA1 hibridada y OVA2 encapsulada en nanopartículas separadas o en una sola construcción de DA-SNA conduce a una expresión significativa de CD80 y CD86. Tras el análisis de un rango de dosis, se produce una expresión elevada de CD80 y CD86 cuando se usan concentraciones más altas, y no se debe a una interacción preferida del MHC-I con el péptido que podría conducir a una mayor internalización. Esta tendencia también se muestra, aunque en menor medida, cuando se utilizan SNA que contienen un conjunto diferente de péptidos (Datos ampliados, Fig. 1). La presentación de antígenos a células T esplénicas vírgenes para generar células T específicas de antígeno, un indicador de la capacidad del sistema inmunitario para reconocer antígenos tumorales35, no se vio afectada por la forma en que se organizaron los antígenos; Las células T ingenuas pudieron expandirse clonalmente en células T específicas de OVA1 y OVA2 (Fig. 1c; estrategia de activación en la Fig. 8 complementaria). De hecho, ~0.6–0.7 % de la población CD19− viva fue doblemente positiva para el dímero OVA1-H-2kb y el marcador CD8+. Se observaron tendencias similares para la diferenciación de células T específicas de OVA2, con ~0.9–1.1 % que contenían marcadores doblemente positivos para el tetrámero OVA2-H-2-Iad y el anticuerpo CD4+. Sólo las estructuras de DA-SNA, y no las formulaciones separadas, fueron capaces de elevar significativamente la cantidad de células T específicas de antígeno por encima de la línea base de control de células T; esto sugiere que la entrega combinada de ambos antígenos a las CD conduce a una diferenciación de células T más fuerte. Esto es más evidente cuando se evalúa la expresión del marcador de activación temprana CD69 dentro de cualquiera de las poblaciones de células T específicas de antígeno. Una mayor cantidad de señal de CD69 (medida por la intensidad de fluorescencia media, MFI) está presente cuando los antígenos se administran combinados como un DA-SNA, con la estructura DA-SNA 2 superando a todos los grupos probados (Fig. 1d). Además, la entrega de antígenos en estructuras DA-SNA, independientemente de la ubicación del antígeno, se traduce en un aumento del doble en la proliferación de células T, un paso importante en las respuestas antitumorales, utilizando esplenocitos OT1 específicos para el antígeno OVA1 (Fig. 1e).

Sobre la base de estos hallazgos prometedores in vitro utilizando DA-SNA, evaluamos cómo la disposición de los antígenos administrados afectó las respuestas inmunitarias in vivo. Se inmunizaron ratones C57BL/6 para delinear cómo la formulación del antígeno en nanoestructuras separadas o iguales y cómo la diferente ubicación de los antígenos restringidos por MHC-I y MHC-II dentro de las vacunas DA-SNA afecta la activación inmunológica. Los ratones recibieron tres inyecciones en total (6 nmol por ADN y cada péptido; Fig. 2a y Datos ampliados Fig. 2). El día 35, se recogieron esplenocitos para evaluar las respuestas inmunitarias específicas elevadas frente a ambos antígenos peptídicos. Después del período de 5 semanas, los niveles de CD8+ se elevaron significativamente para la inmunización con DA-SNA 2, alcanzando ~35 % de la población de bazo en comparación con una mezcla simple que contenía antígenos peptídicos y ADN adyuvante (denominado "mezcla"), DA-SNA 1, y se usaron los equivalentes separados de ambos DA-SNA (Fig. 2b). Los niveles de CD4+ solo cambiaron significativamente cuando los ratones fueron tratados con el equivalente separado de DA-SNA 1. Otros grupos de tratamiento redujeron el nivel de células T esplénicas CD4+, con el grupo DA-SNA 2 en el nivel más bajo con ~11,4 % de las células de bazo población (Fig. 2b). DA-SNA 2 elevó de manera más significativa la producción de una citocina proinflamatoria clave, IFN-γ, así como el marcador de desgranulación, CD107a, tras la reestimulación con el péptido OVA1 ex vivo. La inmunización con DA-SNA 2 también generó el mayor porcentaje de células T CD8+ esplénicas polifuncionales (~ 15 %, Fig. 2c, la estrategia de activación se puede encontrar en la Fig. 9 complementaria). Además, esto se correlacionó con un aumento en el porcentaje de células T CD8 + de memoria efectora (CD44 + CD62L-, ~ 54%) (Fig. 2d, izquierda). Los niveles de marcadores proinflamatorios producidos en las células T CD8+ y la polifuncionalidad de la población fueron significativamente elevados para la estructura DA-SNA 2 combinada en comparación con su contraparte separada (Fig. 2c). La estimulación ex vivo de células T CD4+ con péptido OVA2 mostró un aumento general en estos mismos parámetros tanto para DA-SNA como para las formulaciones separadas en comparación con el tratamiento de mezcla, lo que demuestra aún más la importancia de la administración combinada de antígeno y adyuvante a una célula inmunitaria. No se observaron diferencias significativas entre la estructura DA-SNA 1 y su equivalente separado. Estas dos construcciones indujeron los niveles más altos de estos marcadores proinflamatorios en las células T CD4+, aunque no se observó una disminución estadísticamente significativa entre los dos DA-SNA (Fig. 2c). Además, la mayor elevación en las células T CD8 + específicas de OVA1 se observó para DA-SNA 2, ~ 3 veces más que su equivalente separado (Fig. 2e). En última instancia, la contribución de la administración combinada de ambos tipos de antígenos en las estructuras DA-SNA condujo a una mayor secreción de IFN-γ, medida a través de un ensayo de punto inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISpot). Los niveles de células formadoras de manchas (SFC) después de la estimulación ex vivo con el antígeno OVA1 restringido por MHC-I fueron más altos con DA-SNA 2, y DA-SNA 2 generó SFC 2,3 veces más altas que su contraparte por separado con MHC-I o Estimulación ex vivo del antígeno MHC-II (OVA2) (Fig. 2f). Se observó una elevación en SFC para ambas estructuras DA-SNA en comparación con la mezcla; la mayor mejora general se observó para DA-SNA 2. Los esplenocitos producidos por la inmunización con DA-SNA 2 dieron lugar a ~2,2 veces y ~1,7 veces más SFC que la inmunización con DA-SNA 1 cuando se estimularon ex vivo con OVA1 u OVA2, respectivamente , demostrando la potencia usando esta disposición de antígenos en un DA-SNA para responder ex vivo a señales de antígeno restringidas por MHC-I o restringidas por MHC-II. La administración de antígenos OVA1 encapsulados y OVA2 hibridados mostró diferencias entre las formulaciones separadas y combinadas, con la estructura combinada de DA-SNA 1 elevando las SFC en mayor medida con la estimulación ex vivo de OVA1, y la formulación separada elevando las SFC en mayor medida con OVA2 estimulación ex vivo. Tomando todo este estudio de manera holística y dado el papel de las células T CD8+ en la actividad antitumoral y la importancia de activar ambos subconjuntos de respuestas de células T de manera efectiva, aprovechamos la entrega combinada de antígeno en las estructuras DA-SNA en una experimentación adicional. En general, al evaluar las diferencias en las respuestas inmunitarias entre los DA-SNA, los resultados destacan que colocar el antígeno restringido por MHC-I en la arquitectura híbrida optimiza la presentación de DC para las respuestas de células T CD8+, al tiempo que encapsula el antígeno restringido por MHC-II dentro del core induce modestas mejoras en la actividad de CD4+ mientras preserva la función citotóxica.

a, Programa de inmunización quincenal para ratones C57BL/6. Varios grupos de tratamiento en estudio. Dosis: 6 nmol por antígeno; 6 nmol de adyuvante. b, Cambio en las poblaciones de células T CD8+ (izquierda) o CD4+ (derecha) en el bazo después del esquema de vacunación. c, Se evaluó la producción intracelular de citocina proinflamatoria IFN-γ (izquierda) o marcador de desgranulación CD107a (centro) tras la reestimulación ex vivo con antígeno peptídico. Las células T polifuncionales (doble positivas para ambos marcadores) se cuantificaron (derecha) para células T CD8+ (arriba) o CD4+ (abajo). DA-SNA 2 elevó significativamente la producción de todos los marcadores en las células T CD8+, mientras que las diferencias fueron más sutiles entre la producción en las células T CD4+, y ambos DA-SNA elevaron los niveles por encima de los de los ratones inmunizados con una vacuna mixta. d, el fenotipo de memoria efectora, medido a través de los marcadores CD44+CD62L-, aumentó con DA-SNA 2 para las células T CD8+ (izquierda). La función efectora de CD4+ (derecha) fue más elevada para Separate 1 Encap. 2 hib. inmunización. e, Porcentaje de células T CD8+ que son específicas de OVA1, medido mediante tinción con un dímero específico de antígeno. f, Recuentos e imágenes representativos (izquierda) de células T esplénicas secretoras de IFN-γ tras diferentes estimulaciones ex vivo junto con SFC totales medidos mediante el ensayo ELISpot (derecha). Se muestra la media ± sem. n = 3–6 ratones por grupo. Se muestra la significancia estadística entre las comparaciones relevantes. Para todos los paneles, la significación se calculó usando un ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (b, c, d, f) o Dunnett (e).

Para evaluar los posibles factores que impulsan estas diferencias en la activación in vivo, evaluamos la vía de administración de las estructuras tras la inmunización. Administramos DA-SNA por vía subcutánea con etiquetas de fluoróforo para ambos antígenos peptídicos y evaluamos la biodistribución después de 24 h (Fig. 10 complementaria). No se observaron diferencias significativas en la acumulación de órganos entre los dos DA-SNA para el antígeno hibridado. El antígeno encapsulado se concentró principalmente en el ganglio linfático y se detectó muy poco en otros órganos principales y, lo que es más importante, se observó un aumento significativo en la acumulación como resultado de la inmunización con DA-SNA 2. Intentamos evaluar si el tráfico de ganglios linfáticos podría explicarse por una diferencia en la tasa de liberación de los antígenos de las estructuras DA-SNA (Figura complementaria 11). Los perfiles de liberación realizados en soluciones fisiológicamente relevantes (10 % FBS) ex celulo mostraron niveles relativamente bajos de liberación para el antígeno hibridado dentro de las 48 h, mientras que el antígeno encapsulado alcanzó más del 63 % de liberación para DA-SNA 1 y algo menos del 50 % de liberación para DA -SNA 2. Sin embargo, hemos observado captación de SNA en tan solo 30 min25. Al observar los perfiles de liberación de los DA-SNA dentro de las primeras horas de exposición al suero, las estructuras exhiben las mismas tasas de liberación, que también son <25 % del antígeno encapsulado total. Se ha descubierto previamente que la estabilidad de la cubierta del liposoma y, por lo tanto, del SNA, conduce a diferencias en la distribución29,36. Postulamos que la estabilidad de los liposomas, influenciada por la carga de péptidos37,38, conduce a las diferencias observadas en la distribución de péptidos encapsulados en DA-SNA. No obstante, enfatizamos que este parámetro debe ser una consideración de diseño para seleccionar la carga de péptidos, que varía según el conjunto de antígenos, y este trabajo ilustra importantes mejoras de vacunas basadas en estructuras a través de múltiples conjuntos de antígenos diferentes. Por lo tanto, concluimos que los cambios significativos en todo el sistema inmunológico observados in vivo no pueden atribuirse únicamente a las diferencias en la biodistribución o las tasas de liberación de antígenos entre las dos nanopartículas. Además, al evaluar el tráfico de los antígenos en las CD esplénicas (Fig. 12 complementaria), no se pueden resolver las diferencias entre los dos DA-SNA y, lo que es más importante, ambos generan una población significativa de antígenos doblemente positivos en las CD en comparación con ratones ingenuos y ratones administrados con una mezcla simple de los componentes. Como resultado de la variación mínima entre los DA-SNA en función de la distribución y el tráfico a nivel de órganos, realizamos un análisis del transcriptoma de células dendríticas para evaluar cómo el tratamiento con las vacunas estructuradas de manera diferente afecta el enriquecimiento de la vía y la expresión génica general (Suplementario Fig. 13 y Conjunto de datos 1). Las estructuras DA-SNA afectan las vías de las células dendríticas de manera muy diferente en comparación con el tratamiento con mezcla, donde se enriquecieron pocas vías significativas. El análisis de enriquecimiento de la ruta entre DA-SNA 1 y 2 sugiere que DA-SNA 2 afecta la internalización y el procesamiento de la ruta de los componentes en mayor medida que DA-SNA 1.

Intentamos resolver las vías de procesamiento de DA-SNA 1 y 2 dentro de las células dendríticas en un esfuerzo por dilucidar este impacto en la cinética de señalización. Usando microscopía confocal (Fig. 3), evaluamos el destino intracelular de DA-SNA después de la absorción por BMDC en puntos de tiempo predeterminados y comparamos la co-localización de los antígenos hibridados y encapsulados con marcadores de orgánulos para el endosoma temprano (antígeno 1 del endosoma temprano , EEA1), endosoma tardío (Rab7), lisosoma (proteína 1 de membrana asociada al lisosoma, Lamp1), retículo endoplásmico (proteína disulfuro isomerasa, PDI), MHC-I y MHC-II. Los datos destacan que el procesamiento sustancial ocurre en puntos de tiempo anteriores (es decir, <1 h). El procesamiento dentro del endosoma temprano demuestra una cinética comparable entre las dos estructuras (Fig. 3a). Las diferencias significativas entre las dos estructuras surgen en el endosoma tardío (Fig. 3b), donde hay un mayor procesamiento y tráfico para los antígenos hibridados y encapsulados para la estructura DA-SNA 2 en comparación con ambos antígenos para DA-SNA 1. Evaluación de el lisosoma reveló diferencias clave; existe una co-localización disminuida para el antígeno hibridado de DA-SNA 2 (MHC-I restringido) y una mayor co-localización para el antígeno encapsulado para DA-SNA 2 (MHC-II-restringido) (Fig. 3c), lo que sugiere optimización de la carga de MHC-II para DA-SNA 2. Observamos que el antígeno hibridado de DA-SNA 1 (restringido por MHC-II) exhibe una mayor co-localización con el lisosoma en puntos de tiempo tempranos, pero esto disminuye rápidamente y no hay cambios significativos. los aumentos se observan más adelante en el estudio. Esto también sugiere que cualquier ruta de procesamiento optimizada de DA-SNA 1 es más transitoria, ya que tampoco se observa una mayor colocalización del antígeno hibridado con DA-SNA 1 (restringido por MHC-II) con MHC-II. El análisis del procesamiento en el retículo endoplásmico (RE) no mostró diferencias importantes entre el tratamiento con DA-SNA para los antígenos hibridados. Esto podría atribuirse a una cinética de presentación cruzada más rápida con la disposición estructural DA-SNA 2 para el antígeno hibridado y, por lo tanto, a una captura menos eficaz de este proceso (Fig. 3d). Por el contrario, la coubicación reducida del antígeno encapsulado ER y DA-SNA 2 (restringido por MHC-II), significativa en el punto de tiempo de 1 h, podría atribuirse a la disminución del tráfico del antígeno restringido por MHC-II encapsulado para DA-SNA 2 a urgencias. Es importante destacar que el antígeno hibridado de DA-SNA 2 (MHC-I restringido) exhibió una mayor co-localización con MHC-I en puntos de tiempo tempranos (tan pronto como 30 min), con aumentos significativos observados hasta 1 h (Fig. 3e), lo que se traduce en una presentación de superficie OVA1 impulsada por DA-SNA 2 aumentada en MHC-I (Fig. 14 complementaria). Si bien no es significativo, existe una tendencia de aumento en el antígeno encapsulado DA-SNA 2 (restringido por MHC-II) con MHC-II en puntos de tiempo posteriores (Fig. 3f). Como existe una colocalización significativa del antígeno encapsulado en DA-SNA 2 (restringido por MHC-II) con el endosoma tardío y el lisosoma, sugerimos que la carga de MHC-II mediante la incubación con DA-SNA es un proceso más lento que la carga de MHC-I. . Además, las diferencias entre los tratamientos con DA-SNA generalmente disminuyeron a las 6 h, lo que sugiere que las diferencias inmunológicas observadas están impulsadas principalmente por la cinética temprana y el procesamiento de estas estructuras por parte de las DC.

Imágenes de microscopio confocal representativas (arriba) de BMDC incubadas durante 30 min con DA-SNA 1 (izquierda) o DA-SNA 2 (derecha) que contienen antígeno hibridado marcado con Cy5 (rojo) y antígeno encapsulado marcado con FITC (verde). El núcleo se tiñó con DAPI (azul) y se tiñeron los siguientes orgánulos: a, EEA1 (endosoma temprano); b, Rab7 (endosoma tardío); c, Lamp1 (lisosoma); d, PDI (retículo endoplásmico); e, MHC-I; f, MHC-II. Todos los orgánulos se muestran en amarillo. Se muestran los coeficientes de superposición de Mander (abajo) que representan la fracción de la señal Cy5 o FITC co-localizada con los orgánulos respectivos a las 0,5, 1, 6 y 24 h. Barra de escala, 10 μm. g,i, colocalización y h,j, análisis de citometría de flujo del procesamiento de DA-SNA 1 y DA-SNA 2 en BMDC después de un pulso de 1 h y luego de 24 h de tratamiento con cloroquina (g, h) y Brefeldin A (i ,j). Se muestra la colocalización de OVA1 con MHC-I (g) y ER (i). k,l, Colocalización de OVA2 con lisosoma en presencia de leupeptina (k) y MHC-II en presencia de cloroquina (l). Para a–f, los datos muestran la media ± sd de 6–10 campos de visión seleccionados al azar. La significación estadística se calculó usando un ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. Para g–l, los datos muestran la media ± sem para n = 3–6 repeticiones. La significación estadística se calculó utilizando una prueba t no pareada con la corrección de Welch (g, i, k, l) y un ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (h, j).

Para dilucidar aún más las vías involucradas a través de la presentación de antígenos DA-SNA 1 y 2, empleamos inhibidores para evaluar mecánicamente el procesamiento de antígenos. La adición de un disruptor de la acidificación endosomal (cloroquina)39 que se ha demostrado que aumenta el grado de presentación cruzada39,40 afecta la colocalización de OVA1 con los complejos MHC-I. A través de esta presentación cruzada mejorada, observamos que DA-SNA 2 induce una mayor co-localización de OVA1 con MHC-1 (Fig. 3g). Estos datos sugieren que DA-SNA 2 puede aprovechar la presentación cruzada mejorada de manera más efectiva que DA-SNA 1. Esta ventaja arquitectónica se traduce en última instancia en una mayor presentación superficial de OVA1 en MHC-I (Fig. 3h). La adición de Brefeldin A, que inhibe el transporte de complejos de péptido-MHC-I ensamblados desde el RE a la membrana celular41 y, por lo tanto, impide la presentación cruzada, tiene un impacto más negativo en DA-SNA 2. Hay una disminución significativa (4,7 veces) en la co-localización del péptido OVA1 con el ER tras el tratamiento con Brefeldin A para DA-SNA 2 (Fig. 3i), lo que se traduce en una pérdida completa de la presentación de la superficie de OVA1 en MHC-I (Fig. 3j). También se analizó el impacto de los inhibidores de la vía en el procesamiento de OVA2. La adición de leupeptina, un inhibidor de las cisteínas y serina proteasas (por ejemplo, catepsinas B, S y L)42, conduce a una caída en la co-localización de OVA2 con el lisosoma (el sitio de carga de MHC-II) para DA-SNA 2 (figura 3k). Por lo tanto, la presentación del antígeno a través de DA-SNA 2 se ve más negativamente afectada en el procesamiento de MHC-II tras la adición del inhibidor. Además, el uso de cloroquina, conocida por bloquear el procesamiento de antígenos dependiente de MHC-II43,44,45, dificulta la capacidad de OVA2 en DA-SNA 2 para co-localizarse con MHC-II (Fig. 3l). Por lo tanto, DA-SNA 2 se ve más afectado por la adición de inhibidores que interrumpen el procesamiento de MHC-I y -II, lo que indica que la presentación y los perfiles cinéticos que proporciona DA-SNA 2 son más adecuados para el procesamiento de antígenos.

Para comprender cómo los diferentes DA-SNA y los tratamientos de mezcla inducían respuestas tan variadas de células T aguas abajo, recolectamos y aislamos células T CD8 + y CD4 + esplénicas después de la inmunización siguiendo el mismo programa en la Fig. 2 y realizamos secuenciación de ARN a granel (RNAseq). El análisis de componentes principales (PCA) reveló holísticamente que los perfiles de expresión génica de células T CD8+ y CD4+ de ratones inmunizados con formulaciones de mezcla eran más similares a los de ratones sin tratamiento previo, lo que sugiere que esta es la causa de la baja activación general (Fig. 4a). Los ratones inmunizados con DA-SNA 2 eran más distintos de los ratones ingenuos en su transcriptoma CD8+, mientras que tanto DA-SNA 1 como 2 diferían de los ratones ingenuos en sus perfiles de expresión génica en células T CD4+ de manera similar. Esto sugiere una justificación para los aumentos significativos en la función de las células T CD8+ inducidas por DA-SNA 2, pero niveles similares de función de las células T CD4+ entre ambos DA-SNA observados en la Fig. 2. Además, genes regulados diferencialmente para ratones inmunizados con DA-SNA 2 exhibieron mayores cambios logarítmicos absolutos (LFC) en ambos tipos de células T en comparación con los otros tratamientos, con al menos el doble de genes regulados diferencialmente como resultado de la inmunización con DA-SNA 2 en comparación con DA-SNA 1 (Fig. 4b) . Los genes regulados diferencialmente se enriquecieron en vías que involucran respuestas inflamatorias y regulación positiva de citocinas proinflamatorias, quimiotaxis y migración de poblaciones clave de células inmunitarias (Fig. 4c y Conjunto de datos complementarios 2). Si bien algunas de las vías enriquecidas del tratamiento con DA-SNA 2 se compartieron con el tratamiento de mezcla y otras con el tratamiento con DA-SNA 1, en general, la activación generalizada inducida a nivel del transcriptoma para la arquitectura de DA-SNA 2 se correlacionó con resultados inmunológicos mejorados. .

a, gráfico PCA del transcriptoma completo de células T CD8+ (izquierda) y CD4+ (derecha). b, Cambios en la expresión génica representados por subconjuntos de LFC para poblaciones de células T CD8+ (izquierda) y CD4+ (derecha) como resultado de diferentes tratamientos. c, Selección de rutas significativamente enriquecidas calculadas mediante análisis GSEA. Los colores de los cuadrados corresponden a la puntuación de enriquecimiento de cada vía como resultado de diferentes tratamientos para las células T CD8+ (izquierda) y CD4+ (derecha). d, Firmas de genes para células T CD8+ (arriba) y CD4+ (abajo). Los colores se refieren a los niveles de expresión génica normalizados (puntuación z). Selección de genes relevantes marcados. e, Gráficos de volcán de células T CD8+ (izquierda) y CD4+ (derecha) entre una comparación por pares de DA-SNA 2 y DA-SNA 1. Los puntos coloreados indican genes expresados ​​significativamente; un LFC positivo indica una regulación positiva de DA-SNA 2 con respecto a DA-SNA 1 (rojo), mientras que un LFC negativo indica una regulación negativa de DA-SNA 2 con respecto a DA-SNA 1 (azul).

Se identificaron firmas genéticas relevantes para la activación y el funcionamiento de la inmunidad innata y adaptativa en todos los tratamientos e incluyen, por ejemplo, CXCR3, TNFSF9 y GZMK (Fig. 4d y Conjunto de datos complementario 3). Estos genes tienen una relevancia particular en la función y el tráfico de células T efectoras, la presentación de antígenos y la generación de células T citotóxicas y la función citolítica de las células T colaboradoras, respectivamente. Una comparación particular de DA-SNA 2 versus DA-SNA 1 demuestra diferencias genéticas únicas inducidas a nanoescala simplemente alterando la ubicación de la clase de antígeno (Fig. 4e). Se detectaron un total de 452 y 229 genes significativos superpuestos en células T CD8+ y CD4+, respectivamente, entre ambos DA-SNA. Específicamente, DA-SNA 2 indujo una mayor expresión de IL2RA, CD44 y XCL1 en células T CD8+ y LAG3, CCR7 y CCL9 en células T CD4+ en comparación con DA-SNA 1. En última instancia, la comparación de firmas genéticas en todos los tratamientos de inmunización destaca el impacto sustancial que la estructura de la vacuna y, en particular, la ubicación del antígeno a nanoescala, tienen sobre el genoma y los patrones de expresión. Estos resultados subrayan las mediciones inmunológicas que se detectaron, proporcionando una justificación mecánica que destacó las vías que conducen a la activación de las células T y las respuestas duraderas, y detallan un marco para el diseño de vacunas utilizando consideraciones de estructura con un propósito.

Para evaluar la eficacia terapéutica y el impacto inmunológico de los DA-SNA, empleamos un modelo de cáncer de linfoma E.G7-OVA murino debido a su expresión estable de la proteína OVA, que expresa los epítopos OVA1 y OVA2 utilizados anteriormente46. Brevemente, los ratones C57BL/6 se inocularon por vía subcutánea con células E.G7-OVA y se inmunizaron semanalmente con DA-SNA o formulaciones mixtas (6 nmol de cada antígeno OVA1 y OVA2, 6 nmol de ADN adyuvante) (Fig. 5a). Los ratones portadores de tumores inmunizados con DA-SNA 2 demostraron una reducción de ~3 veces en el crecimiento tumoral en comparación con los grupos de control (tratados con solución salina) y de mezcla tan pronto como 5 días después de la segunda inmunización (día 15) y más de 16 días después de la segunda inmunización (día 15). diferencia de veces en el crecimiento del tumor en comparación con ratones tratados con solución salina 22 días después de la inoculación del tumor (Fig. 5b y Fig. 15 complementaria). Es importante destacar que el tratamiento con DA-SNA 1 no detuvo de forma eficaz el crecimiento tumoral en comparación con la mezcla, a diferencia del tratamiento con DA-SNA 2. En comparación con la mezcla y DA-SNA 1, DA-SNA 2 produjo una reducción de ~7 veces en el crecimiento tumoral en el día 24, lo que destaca el impacto pronunciado del posicionamiento del antígeno y, en última instancia, se traduce en una extensión significativa en la supervivencia animal (supervivencia media). en días: PBS = 27; Admix = 24; DA-SNA 1 = 28; DA-SNA 2 = 35) (Fig. 5c). Para investigar más a fondo el impacto físico del tratamiento en el crecimiento tumoral, se extirparon los tumores de los ratones el día 15 siguiendo el mismo régimen de tratamiento y posteriormente se pesaron (Fig. 5d y Fig. 16 complementaria). Curiosamente, en este punto de la curva de crecimiento del tumor, ambos grupos de SNA mostraron una reducción significativa en el peso de los tumores en comparación con los ratones tratados con PBS, lo que sugiere que DA-SNA 1 es capaz de generar una respuesta inmunitaria antitumoral, pero esta respuesta no es tan duradera. como la planteada por DA-SNA 2.

a–c, los ratones C57BL/6 se inocularon por vía subcutánea (a) con células E.G7-OVA (5 × 105) en el flanco derecho y se les administraron inmunizaciones semanales a partir del día 3 para un total de cuatro vacunas (adyuvante 6 nmol, 6 nmol de cada antígeno). Se muestran las curvas de crecimiento promedio (b) y supervivencia animal (c). Se muestran los valores de P para el volumen en el día 24 de DA-SNA 2 en comparación con DA-SNA 1 y Admix (b). Los datos muestran la media ± sem de dos experimentos independientes con n = 7–9. d, Pesos después del programa de tratamiento representado en a (en el día 15). e, Izquierda: evaluación de células T CD8+ inmunitarias en el bazo al final del experimento. Derecha: proporción de células T CD8+/CD4+. f-i, Análisis de citometría de flujo en el día 15 de PBMC aisladas de ratones con tumores según el programa que se muestra en a. f, células T CD8+ específicas para el antígeno OVA1. g, linfocitos T CD8+ de memoria efectora (CD44+/CD62L-) dentro de este subconjunto de linfocitos T específicos de antígeno. h, células T CD4+ específicas para el antígeno OVA2. i, Células T CD4+ de memoria efectora (CD44+/CD62L−). Los datos muestran la media ± sem con n = 4–6 ratones por grupo. Para b, d-g e i, la significancia se calculó mediante un ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. El panel h usó un ANOVA de Welch seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett debido a diferencias significativas en sd entre grupos. El panel c se analizó utilizando una prueba de rango logarítmico.

Datos fuente

Las diferencias inmunológicas resultantes de la administración de múltiples antígenos se dilucidaron aún más mediante la recolección de bazos de ratones portadores de tumores E.G7-OVA y la evaluación de cambios en las células T CD8+ y CD4+ esplénicas (Fig. 5e). Los bazos de los ratones tratados con DA-SNA 2 generaron un porcentaje significativamente mayor de células T CD8+ en comparación con otros grupos de tratamiento y también mostraron una proporción general más alta de células T CD8+ a CD4+. Para evaluar las diferencias inmunológicas que contribuyeron a la supresión del tumor, se evaluó la presencia de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en ratones C57BL/6 portadores de tumores el día 15, cuando se observaron por primera vez las diferencias en el crecimiento del tumor y cuando el impacto de DA-SNA 2 el tratamiento comenzó a detener el crecimiento del tumor, mientras que los otros tratamientos tuvieron un impacto insignificante. En particular, los ratones tratados con DA-SNA 2 mostraron el nivel más alto de células T CD8 + específicas de antígeno circulantes (Fig. 5f, estrategia de activación en la Fig. 17 complementaria). Este subconjunto de linfocitos CD8+ se evaluó más en cuanto a su fenotipo de memoria. En este caso, el tratamiento con DA-SNA 2 elevó significativamente el fenotipo de memoria efectora a más del 60 % de las células T CD8+ circulantes específicas de OVA1 (Fig. 5g). Las células T CD4+ específicas de antígeno también se elevaron significativamente en los ratones tratados con los DA-SNA (Fig. 5h). Como era de esperar, debido a los perfiles transcriptómicos y los parámetros inmunológicos explorados previamente en este documento para las células T CD4+, hubo diferencias insignificantes entre los dos grupos DA-SNA. Si bien no hubo suficientes células T CD4+ específicas de OVA2 para delinear con precisión el fenotipo de memoria dentro de esta subpoblación, la totalidad de las células T CD4+ demostraron un estado de memoria efector mejorado cuando se trataron con DA-SNA 1 (~30 % de las células T CD4+) en comparación con tratamiento con DA-SNA 2, que maduró ~10 % de las células T CD4+ (Fig. 5i).

Para determinar la versatilidad y traducibilidad de las reglas de diseño para guiar la ubicación estructural para la vacunación multiantígena, empleamos el modelo de carcinoma de colon MC-38 conocido por su alta carga mutacional47. Brevemente, los ratones C57BL/6 se inocularon por vía subcutánea con células MC-38 y se inmunizaron semanalmente con DA-SNA que contenían neoantígenos MHC-I 'Adpgk I'14 y 'Adpgk II', un antígeno que se predijo que se uniría de manera efectiva a MHC-II (https: //www.iedb.org y referencias 48, 49, 50) (6 nmol de cada uno de los antígenos Adpgk I y Adpgk II, 6 nmol de ADN adyuvante) (Datos ampliados Fig. 3a–c). El crecimiento tumoral se inhibió de manera similar para ratones inmunizados con DA-SNA 2, con una extensión significativa en la supervivencia conferida a estos animales (mediana de supervivencia en días: PBS = 27; DA-SNA 2 = 38). Estas diferencias probablemente sean el resultado de una combinación de aumentos significativos en el microambiente tumoral y entre las células inmunitarias circulantes elevadas. Las células T CD8+ y CD4+ aumentaron en el microambiente tumoral (Datos ampliados Fig. 3d,e, estrategia de activación en la Fig. 18 complementaria) y se observó una reducción significativa en las células supresoras derivadas de mieloides Gr-1+CD11b+ (Datos ampliados Fig. 3f). Además, el tratamiento con DA-SNA 2 aumentó el porcentaje de células T CD8+ específicas de Adpgk I e indujo inmunidad de células T adaptativas esplénicas. Tras la estimulación ex vivo de Adpgk I y II, los esplenocitos tratados con DA-SNA 2 secretaron más interferón gamma que los esplenocitos tratados con DA-SNA 1 o PBS (Datos extendidos Fig. 3g, h).

Los hallazgos aprendidos con respecto a la estructura de DA-SNA hasta ahora se usaron para evaluar la capacidad de la colocación de antígeno dual para impactar el crecimiento de los tumores de melanoma B16-F10. Este modelo se ha establecido como altamente agresivo con propiedades inmunosupresoras mejoradas51. Los neoepítopos M27 y M30 informados recientemente52 que contenían mutaciones presentes solo en el tumor se seleccionaron como antígenos MHC-I y MHC-II, respectivamente. Inicialmente, los ratones C57BL/6 inoculados con células tumorales B16-F10 y que recibieron una vacunación semanal 3 días después de la inoculación del tumor de DA-SNA 1 o DA-SNA 2 mostraron una inhibición en el crecimiento tumoral el día 17 en comparación con los ratones tratados con solución salina. (68% y 48%, respectivamente) (Fig. 6a,b). De hecho, se observó un aumento estadísticamente significativo de ~ 4 veces en las células T CD8 + específicas del antígeno efector de memoria circulante para los ratones tratados con ambos DA-SNA en relación con el tratamiento con solución salina (Fig. 6c, estrategia de activación en la Fig. 17 complementaria). Por lo tanto, se produce una respuesta inmunitaria específica de antígeno, pero el impacto insignificante que tiene sobre el crecimiento tumoral indica la probabilidad de un entorno tumoral altamente inmunosupresor que inhibe el potencial terapéutico de estas células T.

a,b, ratones C57BL/6 se inocularon por vía subcutánea (a, arriba) con células B16-F10 (105) en el flanco derecho y se les administraron inmunizaciones subcutáneas semanales a partir del día 3 para un total de cuatro vacunas (adyuvante 9 nmol, adyuvante 9 nmol de cada antígeno). Se muestran las curvas de crecimiento promedio (a, abajo) y la supervivencia de los animales (b). c, células T CD8+ específicas para el antígeno M27 y marcadores de células T CD8+ de memoria 44+/62− en PBMC aisladas. Los datos muestran la media ± sem de dos experimentos independientes con n = 6–7. d, e, ratones con tumor B16-F10 que reciben inmunizaciones subcutáneas semanales de DA-SNA combinadas con un inhibidor del punto de control inmunitario anti-PD-1 administrado por vía intraperitoneal a los 3 y 6 días después de la inmunización con DA-SNA. Se muestran las curvas de crecimiento promedio (d) y supervivencia de los animales (e). Se muestran los valores de P para el crecimiento comparando anti-PD-1 versus DA-SNA 2 + anti-PD-1 en los días 17, 20 y 22. Los datos muestran la media ± sem de dos experimentos independientes con n = 9–15. f–k, análisis de citometría de flujo en el día 17 de PBMC aisladas de ratones con tumores que recibieron el programa indicado en d. f, Evaluación de las células T CD8+ circulantes. g, Células T CD8+ de memoria efectora total (CD44+/62L−). h, células T CD8+/CD19− específicas de M27. i, Cuantificación de células T CD4+ circulantes. j, Evaluación de las células T CD4+ de memoria efectora (CD44+/62L−). k, células T CD4+/CD19− específicas de M30. Los datos muestran la media ± sem de n = 5–6 ratones por grupo. Para todos los paneles, excepto b y e, la significación se calculó utilizando un ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. La supervivencia animal (b, e) se analizó utilizando una prueba de rango logarítmico. Los hashtags en d indican diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de tratamiento con DA-SNA 2 + anti-PD-1 y anti-PD-1. ND, no detectado.

Datos fuente

Debido a estas observaciones y a la agresividad inherente de este modelo tumoral, los tratamientos con DA-SNA se combinaron con el inhibidor del punto de control inmunitario anti-PD-1, un tratamiento aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA) para el melanoma avanzado, en un esfuerzo por superar la inmunosupresión del tumor53,54. Estos tratamientos comenzaron 3 d después de la inoculación del tumor B16-F10. En particular, cuando se coadministró anti-PD-1 con DA-SNA, se observó una disminución significativa en el crecimiento tumoral a partir de los 17 días posteriores a la inoculación del tumor en animales tratados con la combinación DA-SNA 2 + anti-PD- 1, mientras que no se observó una disminución sustancial en el crecimiento tumoral para los ratones en los otros grupos de tratamiento (Fig. 6d y Fig. 19 complementaria). Esto se tradujo en una extensión del 40 % en la mediana de supervivencia de estos ratones en comparación con los de los grupos tratados con monoterapia con solución salina o anti-PD-1 (Fig. 6e). La importancia y el papel que juega la colocación de antígenos a nanoescala en la conducción de respuestas inmunitarias mejoradas y sinérgicas se pueden extraer de estos resultados. Es importante destacar que una comparación entre los grupos de tratamiento de combinación de DA-SNA reveló una mejora en la supervivencia media general para los animales de combinación DA-SNA 2 + anti-PD-1 (P = 0,0507). La evaluación de células inmunitarias aisladas de sangre periférica destaca aún más esta diferencia inducida por la estructura en la que DA-SNA 2 parece funcionar de forma sinérgica con el inhibidor de puntos de control. Se observó un aumento significativo en las células T CD8+ circulantes para los animales que recibieron un tratamiento combinado de DA-SNA 2 + anti-PD-1 en comparación con todos los demás grupos (Fig. 6f). Curiosamente, cuando se evaluó la población total de células T de memoria efectoras CD8+ entre estas PBMC circulantes, se detectaron aumentos significativos para ambos grupos de combinación DA-SNA + anti-PD-1, con DA-SNA 2 + anti-PD-1 generando memoria efectora. fenotipos en ~60% de las células T CD8+ circulantes (Fig. 6g). Además, solo esta combinación de DA-SNA 2 + tratamiento anti-PD-1 fue capaz de inducir una respuesta robusta de células T CD8+ específicas de antígeno (Fig. 6h). Las observaciones de la circulación de células T CD4+ revelaron un aumento similarmente alto como resultado de la terapia combinada de DA-SNA 2 + anti-PD-1 (Fig. 6i), aunque ambos grupos combinados de DA-SNA + anti-PD-1 elevaron significativamente el efector fenotipo de memoria a ~ 28% de la población de células T CD4 + (Fig. 6j). El tratamiento combinado DA-SNA 2 + anti-PD-1 aumentó los niveles de producción de células T CD4+ específicas de antígeno junto con la monoterapia anti-PD-1 en comparación con el tratamiento DA-SNA 1 + anti-PD-1, aunque no se observaron diferencias significativas. observado entre grupos (Fig. 6k).

Aunque una amplia investigación ha explorado la importancia de los adyuvantes y los antígenos en la creación de nuevas inmunoterapias, hasta ahora no se ha explorado la importancia de la presentación estructural de múltiples antígenos dentro de una construcción específica y su papel en la obtención de una respuesta inmunitaria potente y deseada. En este trabajo hemos demostrado que, para la eficacia de la vacuna, la ubicación del antígeno puede ser tan crítica como la elección del antígeno. De hecho, cuando se altera la colocación de antígenos restringidos por MHC-I y restringidos por MHC-II en dos vacunas de composición casi idéntica, el beneficio del tratamiento contra los tumores cambia drásticamente; una vacuna es potente y la otra es ineficaz. Los orígenes de estas diferencias pueden deberse al posicionamiento del antígeno que afecta la vía de procesamiento que sufre en una célula inmune, así como su tiempo de residencia en diferentes compartimentos celulares. Al cambiar la vía de procesamiento y esta cinética de señalización, esto afecta la respuesta inmune resultante a nivel genético, celular y del organismo. Un MHC-II encapsulado y un antígeno restringido por MHC-I hibridado regulan al alza genes específicos para las respuestas inflamatorias, la quimiotaxis y la migración de células inmunitarias clave, que juntas influyen en la actividad de las células inmunitarias. Estas diferencias genéticas definidas estructuralmente se traducen en un comportamiento inmunológico tras la inmunización in vivo repetida y, en última instancia, definen los perfiles de crecimiento tumoral en múltiples modelos tumorales, incluido el linfoma E.G7-OVA, el carcinoma de colon MC-38 clínicamente relevante y el ratón con melanoma B16-F10. sistemas tumorales. Esta es una demostración clave del impacto del posicionamiento del antígeno de la vacuna en múltiples procesos celulares.

El desarrollo de vacunas se ha centrado en la composición, el número y el tipo de antígeno, y la proporción de estos componentes, casi sin prestar atención a su presentación estructural. Está claro que, además de estos parámetros importantes, la presentación del antígeno debe ser un enfoque en el desarrollo futuro de vacunas. Tener el poder de optimizar la presentación de antígenos para que coincida con un perfil de señalización deseado es fundamental para generar futuras vacunas potentes, donde pequeños cambios en la vacuna en la colocación de antígenos elevan sustancialmente la comunicación célula-célula, la diafonía y la sinergia celular. Esta información se puede aprovechar para los objetivos que aún no se han descubierto, así como para los que ya están en uso. En conjunto, los desarrollos realizados en este trabajo brindan un camino a seguir para repensar el diseño de vacunas contra el cáncer y otras enfermedades.

A menos que se indique lo contrario, todos los reactivos se compraron comercialmente y se usaron tal como se recibieron. Los oligonucleótidos se sintetizaron como se describe a continuación. Los péptidos se adquirieron de Genscript o del núcleo de síntesis de péptidos de Northwestern. Los productos químicos se compraron a los proveedores enumerados entre paréntesis. Se compraron ratones C57BL/6 y ratones hembra C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT1, 003831) de 8 a 12 semanas de edad de Jackson Laboratory. Los ratones se usaron de acuerdo con todas las pautas y regulaciones nacionales y locales, y los protocolos realizados fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Northwestern. Las células E.G7-OVA y B16-F10 se adquirieron de ATCC. Las células MC-38 fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Bin Zhang. Se compraron anticuerpos y los clones se proporcionan en la Tabla complementaria 3.

Los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador ABI 394 utilizando la química estándar de fosforamidita con esqueletos de fosfato o fosforotioato como se indica (Tabla complementaria 1). Después de la síntesis, las hebras se desprotegieron con una solución 1:1 de hidróxido de amonio al 37 %/metilamina al 40 % a 55 °C durante 35 min, a menos que contuvieran un colorante, en cuyo caso se desprotegieron con hidróxido de amonio al 37 % a temperatura ambiente. (rt) durante la noche. A continuación, las hebras se purificaron utilizando una columna C18 o C4 (para hebras que contienen colorante o colesterol) en HPLC de fase inversa, y los picos se recogieron como fracciones. El grupo dimetoxitritilo (DMT) se eliminó de las hebras del producto mediante incubación en ácido acético acuoso al 20 % a temperatura ambiente durante 1 h, seguido de tres lavados con acetato de etilo para eliminar el DMT. El producto final se liofilizó y se resuspendió en agua desionizada (diH2O). La concentración se midió utilizando la absorción UV-vis a 260 nm, con coeficientes de extinción calculados a través de la herramienta en línea IDT OligoAnalyzer (enumerada en la Tabla complementaria 1).

Los oligonucleótidos funcionalizados con tiol en diH2O se redujeron para generar un tiol libre para futuras reacciones. La reducción se realizó utilizando ditiotreitol (100 mM, DTT, Sigma) disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 8,5 a una concentración final de 100 mM a temperatura ambiente durante 45 min. Esta solución se lavó en un filtro giratorio (Amicon) de corte de peso molecular (MWCO) de 3 kDa al menos 3 veces con diH2O. Para los conjugados peptídicos de OVA, el péptido se adquirió en resina y se lavó tres veces cada una con dimetilformamida (DMF) y acetona antes de hacer reaccionar 5 µmol a temperatura ambiente durante la noche con una solución de succinimidil 2-(2-piridilditio)etilcarbonato (SDEC, elaborado con protocolos anteriores55 ) disuelto en DMF (10 equivalentes con respecto a la carga peptídica inicial sobre el soporte sólido), con N,N-diisopropiletilamina (5 equivalentes). Posteriormente, las perlas se lavaron tres veces con DMF y luego con acetona, y se secaron al aire antes de desprotegerlas con ácido trifluoroacético al 95 % (triisopropil silano al 2,5 %, diH2O al 2,5 %) durante 1 hora a temperatura ambiente. El ácido trifluoroacético se eliminó usando nitrógeno y las perlas se volvieron a disolver en DMF y se filtraron a través de lana de vidrio. El producto peptídico se precipitó añadiendo ~5–6 veces éter dietílico y se dejó a -20 °C durante 1–2 h para precipitar aún más. La solución se centrifugó (2000 × g, 3 min) para sedimentar el péptido, que se recogió, secó y disolvió en DMF. El ADN reducido (0,5 µmol) se hizo reaccionar durante la noche a temperatura ambiente con el péptido disuelto (5 µmol) en DMF al 70–75 % en agua para un volumen de reacción total de ~1,5 ml. Para los conjugados peptídicos, los péptidos se activaron usando 2,2'-ditiodipiridina (150 µmol) disuelta en 10 equivalentes de DMF con agitación suave durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, el péptido activado se lavó 3 veces en éter dietílico, se sedimentó mediante centrifugación (2000 × g, 3 min) y se dejó secar. El ADN reducido (0,3 µmol) se hizo reaccionar durante la noche a temperatura ambiente con el péptido disuelto (1,5 µmol) en ~70 % de DMF en agua para un volumen de reacción total de ~1,5 ml.

Después de la conjugación del péptido, las soluciones se centrifugaron a 17 000 × g durante 2 min para sedimentar cualquier péptido precipitado, y el sobrenadante se transfirió a filtros giratorios MWCO de 3 kDa para 3–4 lavados con diH2O. El volumen se concentró a <500 μl, y las soluciones se purificaron mediante geles PAGE al 15 % desnaturalizantes a escala preparatoria (urea 8 M) (no más de 0,5 μmol por ADN cargado en un único gel). Los geles se corrieron durante 30 min a 175 V, luego ~3 h a 350 V y, posteriormente, se tomaron imágenes usando una lámpara UV para cortar las bandas deseadas. Las bandas de gel recortadas se trituraron y el producto se recogió mediante tres lavados con tampón Tris/borato/EDTA 1x cada ~4 h. La masa del producto se confirmó mediante espectrometría de masas de ionización por electropulverización (ESI-MS) y las concentraciones se midieron mediante UV-vis a 260 nm suponiendo un coeficiente de extinción del ADN.

Los SNA se sintetizaron como se informó anteriormente con ligeras modificaciones16,56. Brevemente, se hidrataron películas de lípidos secos de 50 mg de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC, Avanti Polar Lipids) con 3–4 ml de PBS o péptido que contiene PBS para liposomas encapsulados. (Nota: las soluciones que contienen péptido incluido OVA1: 1 mg ml−1 disuelto en PBS que contiene ~100 µl 1 M NaOH; OVA2: 1 mg ml−1 disuelto en PBS que contiene ~60 µl 1 M NaOH; M27: 2,25 mg ml−1 disuelto en PBS que contiene ~60 µl de NaOH 1 M M30: 1 mg ml−1 disuelto en PBS que contiene ~100 µl de NaOH 1 M AgdpkI: 1 mg/ml disuelto en PBS que contiene 120 µl de NaOH 1 M Agdpk II: 0,65 mg/ml disuelto en PBS que contiene 50 μl de NaOH 1 M). Las soluciones se sometieron a 20 ciclos de congelación y descongelación en nitrógeno líquido y luego a sonicación a 37–40 °C. Los liposomas se extruyeron mediante extrusión secuencial a alta presión (Northern Lipids) utilizando filtros de policarbonato con tamaños de poro de 200, 100, 80 y 50 nm; los liposomas se pasaron a través de cada tamaño de poro 3 veces. Después de la extrusión, los liposomas se concentraron hasta ~2–3 ml utilizando filtros giratorios MWCO de 100 kDa y se dializaron durante la noche frente a 3,5 l de PBS para eliminar el péptido no encapsulado. La concentración de liposomas se determinó utilizando un kit de ensayo de fosfatidilcolina (Sigma, MAK049-1KT), asumiendo que un liposoma de 50 nm contiene 18 140 lípidos por liposoma24. La concentración de péptido, si los liposomas encapsulaban péptido, se determinó usando un kit de ensayo de fluorescencia Pierce (ThermoFisher, 23290) agregando dodecilsulfato de sodio (SDS) al 1 % para romper los liposomas y liberar el péptido para la cuantificación, y usando el péptido disuelto en SDS al 1 % como estándar curva. La carga de péptido por liposoma se calculó dividiendo la concentración de péptido por la concentración de liposomas. Las cantidades de cada antígeno por partícula oscilaron entre ~25 y 40 dependiendo del rendimiento de encapsulación de cada lote, que se ajustó usando diferentes concentraciones iniciales.

Los conjugados de oligonucleótido-péptido purificados se mezclaron en una proporción molar de 1:1 con ADN CpG terminado en 3'-colesterol complementario y se centrifugaron durante la noche. Al día siguiente, se agregaron ~20–40 μl de tampón dúplex (IDT) y la solución se enfrió lentamente para duplicar las hebras siguiendo el programa: 70 °C durante 10 min, 23 °C durante 1,5 h, 4 °C para ≥1 h. El dúplex se añadió a una solución de liposomas sintetizados en una cantidad equimolar al péptido encapsulado dentro del liposoma. Para obtener el máximo de 75 hebras por liposoma, el espacio restante se llenó con ADN de T20 terminado en colesterol 3'. Esta mezcla se incubó a 37 °C durante la noche y posteriormente se almacenó a 4 °C.

Los DA-SNA que contenían antígenos marcados con fluoróforo (2 μM en un volumen de 1,5 ml) se colocaron en el dispositivo de diálisis Slide-A-Lyzer MINI en tubos falcon de 50 ml con un 10K MWCO. La solución del tubo Falcon se preparó para ser suero bovino fetal (FBS) al 10% en PBS. Las muestras se cargaron y se dejaron en un rotador y, en los puntos de tiempo especificados, se recogieron 200 μl de muestra y se congelaron a -20 °C hasta su análisis con un lector de placas BioTek.

Todas las células se mantuvieron a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 %. E.G7-OVA, MC-38 y DC se cultivaron con medios RPMI 1640 (Gibco, 11875093) que contenían 10 % de (HI)-FBS inactivado por calor y 1 % de penicilina-estreptomicina, denominados aquí RPMI+/+. B16-F10 se manipularon usando medios DMEM (Gibco, 11965092) que contenían HI-FBS al 10 % y penicilina-estreptomicina al 1 %.

Se recolectaron células de médula ósea de ratones siguiendo un protocolo previo55. Brevemente, los glóbulos rojos se lisaron con 2–3 ml de tampón de lisis ACK (Gibco, A1049201) durante ~4 min y se sembraron en placas de cultivo celular de 10 cm2 con 40 ng ml−1 de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (BioLegend, 576304 ) durante 5 a 7 días antes de su uso para diferenciar las CD de la población.

Las células se recogieron de placas de cultivo celular de 10 cm2 y las DC se aislaron de la mezcla utilizando un kit de selección positiva de biotina magnética (Stemcell Technologies, 17665). Se usó un anticuerpo marcado con biotina CD11c+ para seleccionar las DC (BioLegend) y, después de la separación, las DC purificadas se contaron usando un analizador de viabilidad celular Vi-CELL BLU. Para la activación de DC, se cultivaron 6 × 104 DC con tratamiento SNA en un volumen final de 200 μl para un pulso de 30 min. Luego, las células se lavaron dos veces con RPMI+/+ y se dejaron durante 22 h en una incubadora, después de lo cual las células se lavaron con PBS para finalizar el tratamiento, se tiñeron durante 15 min a 4 °C usando 0,5 μl de cada anticuerpo por tubo (L/D, CD11c, CD86 y CD80), lavado con PBS y fijado con 100 μl de tampón de fijación (BioLegend, 420801). Para los estudios que utilizan un bloqueador de MHC-I, las células se incubaron primero durante 30 min en un volumen de 100 μl con 25 μg ml−1 de anti-MHC-I (BioXCell, E0077). Posteriormente, se agregaron SNA en un volumen de 100 μl a la solución de células y bloqueador y las muestras se pulsaron durante 30 min. Los pasos restantes siguen el protocolo anterior. Para evaluar la activación y la especificidad de las células T, se sometieron a pulso 1,6 × 105 DC purificadas con tratamiento SNA durante 30 min en la incubadora en un volumen final de 200 μl. Después del pulso de 30 min, las células se lavaron dos veces con RPMI+/+ para eliminar cualquier SNA residual de la solución celular y las células se resuspendieron en 500 μl de RPMI+/+. Al mismo tiempo, se aislaron esplenocitos de un ratón ingenuo. Después de la disociación del bazo y la lisis de los glóbulos rojos, se contaron las células y se resuspendieron a una concentración de 3 × 106 células por ml en RPMI+/+ calentado, y se transfirieron 100 μl de esta solución celular a cada pocillo en un recipiente de 96 -bien placa de fondo redondo. A cada pocillo se añadieron 100 μl de DC tratadas (3,3 × 104 células) de modo que la relación DC:esplenocitos fuera de 1:9. Las células se cocultivaron durante 3 días en la incubadora, después de lo cual las células se lavaron con PBS y se tiñeron siguiendo las instrucciones del fabricante para DimerX Mouse H-2Kb:Ig Fusion Protein (BD, 552944) o OVA2 Tetramer (ProImmune). La tinción de anticuerpos además de los marcadores TCR específicos de péptidos incluía L/D, CD8 o CD4, CD19 y CD69. Después de la tinción, las células se fijaron con 100 μl de tampón de fijación. Para evaluar la proliferación de células T, se sometieron a pulso 2,6 × 105 DC purificadas con tratamiento SNA durante 30 min en la incubadora en un volumen final de 200 μl. Después del pulso de 30 min, las células se lavaron dos veces con RPMI+/+ para eliminar cualquier SNA residual de la solución celular y las células se resuspendieron en 266,6 μl de RPMI+/+. Al mismo tiempo, se aislaron esplenocitos de un ratón C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT1) (Jackson, 003831). Después de la disociación del bazo y la lisis de los glóbulos rojos, las células se contaron y se resuspendieron a una concentración de 4 × 107 células por ml en PBS para teñirlas con el colorante de proliferación celular eFluor 450 (eBioscience, 65-0842-85), siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la tinción, las células se lavaron, contaron y resuspendieron en RPMI+/+ a una concentración de 3 × 106 células por ml; Se transfirieron 100 μl de esta solución celular a cada pozo en una placa de fondo redondo de 96 pozos. A cada pocillo se añadieron 33,3 μl de DC tratadas (3,3 × 104 células) de modo que la proporción de DC:esplenocitos fuera de 1:9, y cada pocillo se llevó hasta 200 μl de volumen final con medio. Las células se cocultivaron durante 3 días en la incubadora, después de lo cual las células se lavaron con PBS, se tiñeron para detectar CD8 (0,5 μl de anticuerpo por tubo), se lavaron e inmediatamente se analizaron mediante citometría de flujo utilizando la dilución de eFluor 450 como medida de la concentración de células T. proliferación. Todas las muestras se analizaron con un citómetro de flujo BD A3 Symphony, y los datos se analizaron en FlowJo.

Ratones hembra C57BL/6 fueron inmunizados por vía subcutánea quincenalmente 3 veces con diferentes tratamientos. Los tratamientos incluyeron: mezcla simple (mezcla, 6 nmol de cada péptido y 6 nmol de ADN de CpG 1826), DA-SNA (6 nmol de péptido OVA y CpG 1826) o formulaciones separadas equivalentes de DA-SNA (6 nmol de péptido OVA y CpG 1826). CpG 1826) o un DA-SNA de doble hibridación (denominado 'HH'; 6 nmol de péptido OVA y 12 nmol de CpG 1826). El volumen de tratamiento inyectado se mantuvo en 100 μl. Una semana después de la inmunización final, se sacrificaron los ratones y se recogieron los bazos para una evaluación inmunitaria posterior.

Los bazos extraídos se recolectaron y mantuvieron temporalmente en 3–5 ml de RPMI+/+ hasta que se recolectaron todos los bazos, luego se pasaron a través de un filtro de células de 70 μm con un flujo constante de PBS. Las células se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 min, después de lo cual se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 2-3 ml de tampón de lisis ACK (Gibco, A1049201) durante 4 min. Para diluir el tampón de lisis, luego se agregó PBS a un volumen final de 30 ml, y las células se contaron antes de la centrifugación para resuspenderlas en medios RPMI+/+ a una concentración de 1 × 108 células por ml.

Las células T se reestimularon ex vivo para evaluar la producción de IFN-γ intracelular específica de antígeno. Los esplenocitos (4 × 106) se cultivaron durante 4 h a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 % con 450 μl de medios RPMI+/+ que contenían: péptido OVA1 u OVA2 (10 μg ml−1), monensina (2 μM), Brefeldina A (5 μg ml−1) y anticuerpo CD107a (0,5 μl). Después de las 4 h de incubación, las células se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 min, se aspiraron y se lavaron con 600 μl de PBS antes de 15 min de tinción con anticuerpos de superficie (0,5 μl por muestra de cada uno de: L/D, CD8 y CD4) a 4 °C. C. Las células se lavaron con 600 μl de PBS, se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 min, se aspiraron y se resuspendieron en 100 μl de solución de fijación y permeabilización Cytofix (BD, 554722) durante 20 min a 4 °C. A continuación, las células se lavaron con 600 μl de tampón Perm/Wash (BD, 554723), se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 min, se aspiraron y se resuspendieron en 100 μl de tampón Perm/Wash que contenía el anticuerpo intracelular IFN-γ (0,5 μl por muestra). ). Las muestras se almacenaron a 4 °C antes del análisis de citometría de flujo.

Se evaluó el fenotipo de memoria efectora de las células T. Los esplenocitos (3 × 106) se lavaron con 600 μl de PBS y se tiñeron durante 15 min con anticuerpos de superficie (0,5 μl por muestra de cada uno de: L/D, CD8, CD4, CD44 y CD62L) a 4 °C. Las células se lavaron con 600 μl de PBS, se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 min, se aspiraron, se resuspendieron en 100 μl de tampón de fijación (BioLegend, 420801) y se almacenaron a 4 °C antes del análisis de citometría de flujo.

El análisis ELISpot se realizó utilizando el juego ELISPOT INF-γ de ratón disponible comercialmente (BD, 551083) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, la placa limpia proporcionada se recubrió con anticuerpo de captura durante la noche a 4 °C. Luego, la placa se lavó con medio RPMI+/+ y luego se bloqueó durante 2 h a temperatura ambiente con 200 μl de medio RPMI+/+. El tampón de bloqueo se eliminó pipeteando, teniendo cuidado de no dejar que los pocillos se sequen, y se reemplazó rápidamente con 2 × 105 esplenocitos en 100 μl RPMI+/+. A cada pocillo, se agregaron 100 μl adicionales de antígeno, péptido no específico, medios (control negativo) o soluciones de control positivo (el antígeno y el péptido no específico se agregaron a una concentración final de 5 μg ml−1; el control positivo se preparó como una mezcla de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 a una concentración final de 2 μg ml−1 cada uno). Las soluciones se dejaron en una incubadora a 37 °C en CO2 al 5% durante 48 h. Después de esta incubación, se lavó la placa y se añadieron el anticuerpo de detección, el conjugado enzimático y el sustrato cromogénico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se tomaron imágenes de la placa seca y se analizaron usando un generador de imágenes CTL Immunospot.

Para evaluar la captación y el tráfico intracelular de DA-SNA, se recolectaron BMDC de fémures murinos y se purificaron para CD11c+ (como se describió anteriormente) y posteriormente se sembraron en portaobjetos de 8 cámaras (Lab-Tek, 155409) a 50 000 células por pocillo. Después de la incubación durante la noche, las células se trataron con DA-SNA (2,5 μM) que contenían antígenos OVA1 y OVA2 marcados con fluoróforo durante 0,5, 1, 6 o 24 h. Durante 6 y 24 h, las células se pulsaron durante 2 h con DA-SNA y se reemplazaron con medio fresco durante el tiempo restante. Después de la incubación en los puntos de tiempo indicados, las células se fijaron durante 15 min (BioLegend) y se bloquearon con BSA al 5 % (ThermoFisher) en PBS que contenía Triton-X al 0,1 % durante 1 h. A continuación, las células se tiñeron en busca de marcadores de orgánulos utilizando anticuerpos primarios para EEA1 (proporción 1:700, Abcam), Rab7 (1:500, Abcam), LAMP1 (1:200, ABclonal), PDI (1:50, Señalización celular), MHC -I (1 μg ml−1, BioXCell) y MHC-II (1 μg ml−1, BioXCell) durante la noche a 4 °C antes del etiquetado secundario con Alexa Fluor 555 (EEA1, Rab7, LAMP1 y PDI; Abcam ab150078) y Alexa Fluor 594 (MHC-I y MHC-II; ThermoFisher A48264) durante 1 h a 4 °C. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI durante 1 min y se almacenaron en PBS hasta la obtención de imágenes. La obtención de imágenes se realizó utilizando un microscopio Zeiss LSM 800, manteniendo los mismos parámetros para todas las imágenes. El coeficiente de superposición de Mander se calculó utilizando el software ZEN (Zeiss). Para los estudios de inhibidores (incluidos los realizados mediante flujo), las células se sembraron a razón de 150 000 células por pocillo. Después de la incubación durante la noche, las células se incubaron con cloroquina (5 μM, Sigma), Brefeldin A (2 μg ml−1, BioLegend) o leupeptina (100 μM, Sigma) durante 1 h. Después de 1 h de incubación, se agregaron medios que contenían DA-SNA (2,5 μM) e inhibidores indicados y se pulsaron durante 1 h adicional. Después de pulsar con DA-SNA, los pocillos se lavaron con medios y posteriormente se reemplazaron con medios que contenían inhibidores durante un tiempo total de incubación de 24 h. La tinción de orgánulos se realizó como se describe anteriormente.

Se aislaron células dendríticas, células T CD4+ y CD8+ de esplenocitos completos de grupos de tratamiento individuales después de tres inmunizaciones subcutáneas quincenales usando kits de selección magnética positiva (Stemcell Technologies, 17665, 18952 y 18953). A partir de estas poblaciones de células aisladas, se realizó la extracción de ARN utilizando un mini kit RNeasy Plus (Qiagen) en combinación con QIAshredders (Qiagen) siguiendo las especificaciones del fabricante. La concentración de ARN se cuantificó con un NanoDrop 8000 (ThermoFisher) y las muestras de ARN se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior. La secuenciación se llevó a cabo en las instalaciones centrales de NUSeq de la Universidad de Northwestern. Brevemente, se verificó la calidad de los ejemplos de ARN total utilizando números de integridad de ARN (RIN) generados a partir de Agilent Bioanalyzer 2100. La cantidad de ARN se confirmó con un fluorómetro Qubit. El kit de preparación de bibliotecas de ARNm de cadena TruSeq de Illumina se utilizó para preparar bibliotecas de secuenciación a partir de 125 ng de muestras de ARN de alta calidad (RIN > 7). El procedimiento del kit, que incluye la purificación y fragmentación de ARNm, la síntesis de ADNc, la adenilación del extremo 3', la ligadura del adaptador Illumina, la amplificación y validación de PCR de la biblioteca, se realizó sin modificaciones. Las bibliotecas se secuenciaron con un secuenciador Illumina HiSeq 4000 para generar lecturas individuales de 50 pb a una profundidad de 20 a 25 millones de lecturas por muestra. La calidad de las lecturas, en formato FASTQ, se evaluó mediante FastQC. Las lecturas se recortaron para eliminar los adaptadores Illumina de los extremos 3' utilizando cutadapt57. Las lecturas recortadas se alinearon con el genoma de Mus musculus (mm10) usando STAR58. Los recuentos de lectura para cada gen se calcularon utilizando htseq-count59 junto con un archivo de anotación de genes para mm10 obtenido de Ensembl (http://useast.ensembl.org/index.html). La normalización y la expresión diferencial se calcularon utilizando DESeq2 que empleó la prueba de Wald60. El límite para determinar genes expresados ​​de manera significativamente diferencial fue un valor de P ajustado a la tasa de descubrimiento falso (FDR) inferior a 0,05 utilizando el método de Benjamini-Hochberg.

GSEA61 se realizó para comprender si los genes expresados ​​​​diferencialmente estaban conectados a vías enriquecidas diferencialmente. Los genes detectados con secuenciación de ARN se clasificaron sobre la base de los valores P nominales transformados por log10 obtenidos del análisis DeSeq2 y se compararon con células T vírgenes. El análisis de enriquecimiento de la ruta se realizó utilizando el software GSEA (v4.0.3) y siguiendo el protocolo en la ref. 62. Los conjuntos de genes se obtuvieron de la base de datos de firmas moleculares e incluyeron Reactome y KEGG. La lista clasificada se reasignó utilizando una tecnología CHIP de la base de datos de firmas moleculares que utilizó el símbolo del gen del ratón para reasignar a los ortólogos humanos (v7.1). Un término se definió como diferencialmente enriquecido si tenía un FDR < 0,05. Se seleccionó un subconjunto de rutas fuertemente enriquecidas para su visualización en R utilizando el paquete pheatmap (v1.0.12). Esta selección incluyó todas las vías con un FDR < 0,05 y fue relevante para las respuestas inmunitarias en células T dendríticas, CD8+ y CD4+.

Los genes cuya expresión se alteró significativamente en ambos grupos de tratamiento SNA, según lo definido por FDR P <0,05, se seleccionaron para su visualización como mapas de calor. Los puntajes de expresión génica en FPKM se convirtieron en puntajes z en los grupos de tratamiento y los valores de expresión génica se agruparon utilizando el agrupamiento de K-means. Se realizaron combinaciones por pares entre dos condiciones de interés, estableciendo células T CD4+ o CD8+ vírgenes como controles. Los genes regulados hacia arriba o hacia abajo entre los grupos según lo definido por FDR P <0.05 y el cambio de veces log2 de> 0.5 (regulado al alza) o el cambio de veces log2 <0.05 (regulado a la baja) se visualizaron usando una gráfica de volcán.

Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 de 8 a 12 semanas de Jackson Laboratory. La inoculación del tumor se realizó inyectando a los animales por vía subcutánea (sc) 5 × 105 E.G7-OVA, 105 B16-F10 o 5 × 105 células MC-38 en el flanco derecho. Las inmunizaciones se administraron a una dosis de 6 nmol (OVA1/2 y Adpgk I/II) o 9 nmol (M27/30) de cada antígeno y CpG mediante inyección sc en el abdomen. Las inmunizaciones se administraron como se indica en el programa de tratamiento proporcionado en las figuras respectivas. Para la terapia de combinación con el inhibidor del punto de control inmunitario anti-PD-1, a los ratones se les administraron 100 μg de PD-1 anti-ratón (clon RMP1-14, BioXCell) mediante inyección intraperitoneal. El crecimiento tumoral se midió en días predeterminados y el volumen se calculó usando la siguiente ecuación: volumen tumoral = largo × ancho2 × 0,5. Los animales se sacrificaron cuando los volúmenes del tumor alcanzaron 2000 mm3 (E.G7-OVA) o 1500 mm3 (B16-F10, MC-38) o cuando el animal se volvió moribundo.

La biodistribución de DA-SNA a los órganos principales se realizó en ratones hembra C57BL/6 (n = 3) usando péptidos OVA marcados con fluoróforo y una dosis única a 6 nmol administrada sc Después de 24 h, los órganos completos se recolectaron y almacenaron brevemente en PBS hasta que en la imagen La obtención de imágenes se realizó utilizando un sistema de imágenes In Vivo (IVIS) con filtros de excitación/emisión configurados para 500/540 (FITC) y 640/680 (Cy5). Los antígenos hibridados se marcaron con colorante fluorescente Cy5, mientras que los antígenos encapsulados se marcaron con colorante fluorescente FITC. Los datos se cuantificaron midiendo con el software Living Image v4.5. Los bazos recolectados del análisis de biodistribución se trituraron a través de un filtro de células de 70 μm después de la toma de imágenes. Las células se sedimentaron a 1200 rpm durante 5 minutos y las células se resuspendieron en tampón de lisis ACK (Gibco) durante 4 a 5 minutos. Las células se diluyeron en PBS hasta ~25–30 ml y se contaron. Se colocaron tres millones de células en tubos de flujo y se lavaron con PBS. Las células se incubaron con solución de tinción que contenía 0,5 μl de cada uno de: UV vivo/muerto fijable y CD11c (clon N418, PE) durante 15 min a 4 °C en 100 μl de PBS. El sobrenadante se eliminó después de un lavado y centrifugación, y las células se fijaron en 100 μl de tampón de fijación (BioLegend, 420801) y se almacenaron a 4 °C antes de la citometría de flujo.

Para la recolección de PBMC, los animales se inocularon con células cancerosas como se describe anteriormente. El tratamiento se realizó siguiendo el mismo programa y los animales se sacrificaron el día 15 (E.G7-OVA), el día 16 (MC-38) o el día 17 (B16-F10). La sangre se recogió mediante punción cardiaca en tubos de recogida revestidos con EDTA (BD) y se mezcló brevemente mediante inversión. Los glóbulos rojos se lisaron con tampón de lisis ACK (Gibco) y se lavaron, y las células restantes se tiñeron posteriormente con los métodos descritos anteriormente con anticuerpos para L/D, CD4, CD8, CD19, CD44, CD62L y dímero o pentámero específico de antígeno. , y tetrámero (E.G7-OVA, B16-F10) o L/D, CD8, CD19 y pentámero específico de antígeno (MC-38).

Los pesos de los tumores y la evaluación de los esplenocitos se realizaron en ratones C57BL/6 que tenían un tumor E.G7-OVA en el flanco derecho. A los 3 días después de la inoculación del tumor, se administró la primera inmunización, seguida de una dosis adicional 7 días después (día 10). Los tumores y bazos se extirparon de los animales el día 15 y posteriormente se analizaron. La evaluación del microambiente tumoral se realizó en ratones C57BL/6 que portaban un tumor MC-38 en el flanco derecho. A los 3 días después de la inoculación del tumor, se administró la primera inmunización, seguida de una dosis adicional 7 días después (día 10). Los tumores se extirparon de los animales el día 16 y posteriormente se analizaron. Para generar soluciones unicelulares, los tumores se forzaron mecánicamente a través de un filtro de células de 70 μm mientras se mantenían hidratados en una solución de PBS. Posteriormente, las células se centrifugaron a 1.200 rpm durante 5 min. El sedimento de bazo se resuspendió en tampón de lisis ACK (ThermoFisher) durante 4 min para lisar los glóbulos rojos y posteriormente se neutralizó en PBS antes de la centrifugación. Después de la centrifugación, las células se marcaron con los siguientes anticuerpos: E.G7-OVA: CD4, CD8, CD19 y L/D; MC-38: CD4, CD8, CD45, CD11b, Gr-1 y L/D.

Las estadísticas se calcularon utilizando el software GraphPad Prism 9, y los análisis estadísticos específicos utilizados se destacan en los títulos de las figuras respectivas. Las comparaciones entre múltiples grupos se analizaron con un análisis de varianza (ANOVA) unidireccional con una prueba de comparaciones múltiples de Šidák o Tukey, o un ANOVA de Welch con una prueba de comparaciones múltiples de Dunnett debido a la falta de suposiciones que podrían hacerse basadas en grandes diferencias. en sd entre grupos. Las estadísticas de supervivencia de los animales se calcularon utilizando una prueba de rango logarítmico. Los valores atípicos para la Fig. 5e,f y la Fig. 6h,j se identificaron mediante el método ROUT con un Q establecido en 10 % o 1 %, respectivamente. Para todos los casos, los valores de P se representan de la siguiente manera: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001. La asignación de animales a cada grupo, las inmunizaciones administradas y las mediciones para los estudios se realizaron a ciegas. Los valores en los gráficos se representan como la media ± sem o sd, y esto, así como los tamaños de muestra, se indican en las leyendas de las figuras respectivas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento y su información complementaria. Todos los datos generados en este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Este material se basa en el trabajo respaldado por el Polsky Urologic Cancer Institute of the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center of Northwestern University at Northwestern Memorial Hospital, Edward Bachrach y los premios R01CA208783, R01CA257926 y P50CA221747 del National Cancer Institute of the National Institutes of Health. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. MHT reconoce el apoyo del Premio del Programa de Capacitación en Nanotecnología del Cáncer de la Universidad Northwestern T32CA186897. ME recibió el apoyo parcial de la Beca Dr. John N. Nicholson y la Fundación de Beneficios Públicos Alexander S. Onassis. La síntesis de péptidos se realizó, con un agradecimiento especial a M. Karver, en la instalación central de síntesis de péptidos del Instituto Simpson Querrey en la Universidad Northwestern, que cuenta con el apoyo actual de Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-2025633). Este trabajo hizo uso de las instalaciones de IMSERC MS en la Universidad Northwestern, con un agradecimiento especial a S. Shafaie; esta instalación de EM ha recibido el apoyo de Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-2025633), el Estado de Illinois y el Instituto Internacional de Nanotecnología (IIN). Este trabajo fue apoyado por la instalación central NUSeq de la Universidad de Northwestern.

Estos autores contribuyeron igualmente: Michelle H. Teplensky, Michael Evangelopoulos.

Departamento de Química e Instituto Internacional de Nanotecnología, Universidad Northwestern, Evanston, IL, EE. UU.

Michelle H. Teplensky, Connor M. Forsyth y Chad A. Mirkin

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad Northwestern, Evanston, IL, EE. UU.

Michael Evangelopoulos, Jasper W. Dittmar, Andrew J. Sinegra y Chad A. Mirkin

Programa Interdisciplinario de Ciencias Biológicas, Universidad Northwestern, Evanston, IL, EE. UU.

Connor M. Forsyth, Shuya Wang y Chad A. Mirkin

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MHT, ME y CAM diseñaron los experimentos. MHT, ME, JWD, CMF y SW realizaron los experimentos. MHT y AJS analizaron los datos de secuenciación. MHT y ME analizaron todos los demás datos, que revisaron todos los autores. MHT, ME y CAM escribieron el borrador inicial del manuscrito. Todos los autores revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Chad A. Mirkin.

CAM y MHT tienen intereses financieros en Flashpoint Therapeutics Inc., que podrían beneficiarse potencialmente de los resultados de esta investigación.

Nature Biomedical Engineering agradece a Jeffrey Hubbell y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Expresión en células dendríticas de marcadores coestimuladores con un rango de concentraciones y múltiples conjuntos de péptidos y con bloqueador MHC-I. Leyenda para los diferentes tratamientos en este estudio. b, La expresión (medida a través de la intensidad de fluorescencia media (MFI)) de CD80 (izquierda) y CD86 (derecha) en CD11c + DC según la entrega de las dos clases de antígenos en nanopartículas separadas o en un DA-SNA singular. Se ensayó un rango de concentraciones (por CpG y cada antígeno). c, La adición de un anticuerpo bloqueante anti-MHC-I a las células dendríticas en general no condujo a un gran cambio en la MFI de la señal de CD80 (izquierda) o CD86 (derecha). Todos los cambios en las IMF están alrededor de 1, lo que indica que no hay diferencia. d, Expresión de CD80 (izquierda) y CD86 (derecha) con formulaciones de SNA que contienen neoantígenos M27 y M30. Para todos los paneles, se muestra la media ± sem para n = 3. Se muestra la significación estadística entre las comparaciones relevantes usando ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey.

a, Respuestas inmunitarias in vivo generadas en función de la colocación y formulación del antígeno, incluida una nanoestructura combinada de doble hibridación (HH). Programa de inmunización quincenal para ratones C57BL/6. Dosis: 6 nmol de cada antígeno; 6 nmol de adyuvante. Diferentes grupos de vacunación mostrados en la leyenda. b, Cambio de poblaciones de células CD8+ (izquierda) o CD4+ (derecha) en el bazo después del esquema de vacunación. c, se evaluó la producción intracelular de citocina proinflamatoria IFN-γ (izquierda) o marcador de desgranulación CD107a (centro) tras la reestimulación ex vivo con antígeno peptídico; Análisis de células T CD8+ con estimulación con OVA1 (arriba), análisis de células T CD4+ con estimulación con OVA2 (abajo). Se cuantificaron las células T polifuncionales (doble positivo para ambos marcadores) (derecha). d, fenotipo de memoria efectora, medido a través de marcadores CD44+CD62L−. e, Porcentaje de células T CD8+ que son específicas de OVA1, medido mediante tinción con un dímero específico de antígeno. Se muestra la media ± sem; n = 3-6 ratones por grupo. Se muestra la significancia estadística entre las comparaciones relevantes. Para todos los paneles, la significación se calculó usando un ANOVA de una vía con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (b, c, d) o Dunnett (e).

ac, los ratones C57BL/6 se inocularon por vía subcutánea con células MC-38 (5 × 105) en el flanco derecho y se les administraron inmunizaciones semanales a partir del día 3 para un total de cuatro vacunas (6 nmol de adyuvante, 6 nmol de cada antígeno). Se muestran las curvas de crecimiento tumoral medio, el volumen tumoral en el día 24 y la supervivencia de los animales. df, análisis de citometría de flujo de células aisladas de tumores en el día 16 que recibieron el programa indicado en a. d, Evaluación de células T CD8+ ye, CD4+ entre células inmunitarias CD45+. f, Evaluación de células supresoras derivadas de mieloides Gr-1+CD11b+ en células inmunitarias CD45+. g, análisis de citometría de flujo de PBMC en el día 16 aisladas de ratones portadores de tumores según el programa representado en a. Células T CD8+ específicas para el antígeno Adpgk 1. h, Células formadoras de manchas totales (SFC) medidas mediante el ensayo ELISpot (izquierda) de células T esplénicas secretoras de IFN-γ tras diferentes estimulaciones ex vivo. Recuentos e imágenes representativas (derecha). La estimulación ex vivo de antígeno no específico no dio como resultado ningún SFC, lo que destaca la especificidad de la respuesta. Para ac, los datos muestran la media ± sem de dos experimentos independientes (n = 6-9). Para dh, los datos muestran la media ± sem con n = 6 por grupo, con algunos grupos mostrando menos puntos individuales si los tumores no estaban presentes en el día 16. Para los paneles b, dg, la significancia se calculó usando un ANOVA unidireccional con Tukey's Prueba de comparaciones múltiples. Para el panel h, la significancia se calculó usando un Welch ANOVA seguido de una prueba de comparaciones múltiples de Dunnett debido a las diferencias significativas entre los grupos en la desviación estándar. La supervivencia de los animales en el panel c se analizó utilizando una prueba de rango logarítmico. ns = no significativo.

Datos fuente

Figuras, tablas y referencias complementarias.

Informes de genes y RNAseq de células dendríticas y GSEA.

Informes de RNAseq y GSEA de células T.

RNAseq de células T y lista de genes significativos.

Fuente de datos para las curvas de crecimiento tumoral.

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Reimpresiones y permisos

Teplensky, MH, Evangelopoulos, M., Dittmar, JW et al. Vacunas contra el cáncer de ácido nucleico esférico multiantígeno. Nat. biomedicina ing (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-022-01000-2

Descargar cita

Recibido: 02 Septiembre 2021

Aceptado: 19 de diciembre de 2022

Publicado: 30 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-01000-2

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