La dieta suplementada con calcio y fósforo aumenta el volumen óseo después de treinta días de ejercicio en cinta rodante de alta velocidad en ratones adultos

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 14616 (2022) Citar este artículo

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El ejercicio con pesas aumenta la masa ósea y la fuerza. El aumento de la frecuencia de carga ósea durante el ejercicio puede fortalecer los huesos. La combinación de ejercicio con una dieta suplementada con calcio y fósforo aumenta el área cortical más que el ejercicio solo en ratones. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que combinar el ejercicio en cinta rodante de alta velocidad con la alimentación de ratones con una dieta suplementada con minerales conduciría a una mayor área cortical que el ejercicio de alta velocidad con una dieta estándar y el ejercicio de baja velocidad con una dieta suplementada. Se asignaron ratones C57BL/6 machos de quince semanas de edad a siete grupos: (1) línea base, (2) alimentados sin ejercicio con una dieta de control, (3) alimentados sin ejercicio con una dieta suplementada, (4) alimentados con ejercicio a baja velocidad una dieta de control, (5) ejercicio de baja velocidad alimentado con una dieta suplementada, (6) ejercicio de alta velocidad alimentado con una dieta de control y (7) ejercicio de alta velocidad alimentado con una dieta suplementada. Los ratones se ejercitaron treinta días durante 20 min/día a 12 m/min o 20 m/min. Las tibias se evaluaron mediante micro-CT y flexión de 4 puntos. La fracción del área cortical y la fracción del volumen del hueso trabecular (BV/TV) aumentaron significativamente con la dieta suplementada. Los ratones ejercitados a alta velocidad tenían un peso corporal significativamente menor, sin efectos perjudiciales para la salud ósea. Aumentar la velocidad de carrera puede disminuir el peso corporal mientras se mantienen los beneficios del ejercicio y la nutrición en la salud ósea. Correr puede reducir el peso corporal sin dañar la salud ósea.

El ejercicio con pesas en humanos y ratones puede aumentar la masa ósea, la fuerza a nivel estructural (hueso completo) y/o la calidad del tejido, lo que hace que el hueso sea más capaz de resistir la fractura1,2,3,4. El ejercicio también puede tener beneficios a largo plazo para la salud ósea incluso después de la desentrenamiento5,6,7,8,9,10,11,12,13. En los seres humanos, la masa ósea alcanza su punto máximo a los ~ 25 años de edad y disminuye a partir de entonces. Por lo tanto, es beneficioso maximizar la acumulación de masa ósea en las primeras etapas de la vida para mantener un mayor nivel de masa ósea en la vejez, cuando el ejercicio con pesas se vuelve más difícil de realizar14,15,16.

El hueso responde a la carga del ejercicio aumentando la masa ósea y/o la fuerza ósea para acomodar cargas mayores y prevenir daños17. El ejercicio en humanos y roedores puede aumentar la masa ósea al aumentar la magnitud de la tensión sobre el hueso, lo que lleva a aumentos en el área transversal del hueso18 y la tasa de formación ósea19,20. Las cargas que generan mayores magnitudes de deformación aumentan la tasa de formación ósea cuando se aplican a una frecuencia de carga más alta21. Por lo tanto, los regímenes de ejercicio de mayor intensidad logrados mediante el aumento de la velocidad de la cinta rodante pueden aumentar la formación ósea.

El aumento de la formación ósea puede permitir que el hueso alcance una mayor masa ósea máxima o alcance una masa ósea máxima en un tiempo más corto, lo que permite un aumento más rápido de la resistencia a la fractura. Maximizar la masa ósea con ejercicio podría requerir un mayor suministro de minerales en la dieta para aumentar simultáneamente la masa ósea y la calidad del tejido óseo. Dado que el ejercicio aumenta la demanda de minerales en la dieta22, el ejercicio en cinta rodante puede causar una necesidad aún mayor de minerales que las cantidades normales en la dieta no pueden proporcionar. La combinación de ejercicio en cinta rodante de alta velocidad con una dieta suplementada con calcio y fósforo puede aumentar aún más la masa ósea más allá de lo que puede lograr el ejercicio estándar a menor velocidad.

En condiciones de ejercicio estándar (correr a una velocidad similar a trotar), los roedores ejercitados durante 6 a 12 semanas tienen un mayor contenido de minerales óseos corticales, área, fuerza de fluencia y fuerza máxima13,22,23,24,25. En ratones adultos jóvenes, la combinación de ejercicio con una dieta suplementada con minerales aumenta el área cortical tibial en comparación con el ejercicio con una dieta estándar después de solo 3 semanas2. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que la combinación de una dieta suplementada con minerales con ejercicio en cinta rodante de alta velocidad conduciría a una mayor área cortical que el ejercicio de alta velocidad en una dieta estándar después de un programa de ejercicio relativamente corto de treinta días en ratones adultos jóvenes.

Hubo un efecto principal significativo del ejercicio sobre el peso corporal después de treinta días (p < 0,05, ANOVA de dos vías, Fig. 1). Los ratones en ambos grupos de ejercicio de alta velocidad no aumentaron de peso después del día 8. El mismo efecto sobre el peso corporal se produjo en los ratones que se ejercitaron a baja velocidad mientras recibían la dieta de control. El peso corporal en todos los demás grupos de ratones aumentó continuamente después del día 8. Los ratones de estos grupos terminaron el estudio con un peso corporal significativamente mayor que los ratones de los tres grupos que no aumentaron de peso después del día 8 (p < 0,05, pruebas de Tukey).

Peso corporal del ratón (media ± DE, n = 20/grupo). El ejercicio de alta velocidad limitó las ganancias de peso corporal después de una semana. En el día 29, tanto los grupos de ejercicio de alta velocidad como el grupo de ejercicio de baja velocidad en la dieta de control tenían un peso corporal más bajo que los grupos sin ejercicio y el grupo de ejercicio en la dieta suplementada. *Efecto significativo del ejercicio el día 29 (p < 0,05, ANOVA de dos vías).

La dieta tuvo un efecto principal significativo en la fracción del área cortical (Ct.Ar/Tt.Ar), el área cortical (Ct.Ar) y el grosor cortical (Ct.Th) después de treinta días (p < 0,05, ANOVA de dos vías, Fig. . 2). El ejercicio tuvo un efecto principal significativo sobre Ct.Ar/Tt.Ar, el área transversal total y la longitud tibial (p < 0,05, ANOVA de dos vías). Todos los ratones con la dieta suplementada tenían un grosor cortical significativamente mayor que los ratones con la dieta de control (p < 0,05, pruebas de Tukey). Los ratones que se ejercitaron a baja velocidad con la dieta de control tenían un Ct.Ar/Tt.Ar significativamente más bajo que los ratones de referencia (p < 0,05, pruebas de Tukey). La densidad mineral tisular fue significativamente mayor que la línea de base en todos los grupos con la dieta de control y en los ratones que se ejercitaron a baja velocidad con la dieta suplementada (p < 0,05, pruebas de Tukey). No hubo diferencias significativas entre el ejercicio de alta y baja velocidad para las propiedades del hueso cortical.

Propiedades geométricas y mineralización de la sección transversal del hueso cortical de la diáfisis media de la tibia izquierda del ratón (media ± DE, n = 20/grupo). La dieta aumentó significativamente la fracción del área cortical, el área cortical y el grosor. El ejercicio disminuyó significativamente la fracción del área cortical y la longitud tibial. #Efecto de la dieta significativo (p < 0,05, ANOVA de dos vías). *Efecto significativo del ejercicio (p < 0,05, ANOVA de dos vías). ^Significativamente diferente del valor inicial (p < 0,05, prueba de Tukey). La barra horizontal representa la diferencia significativa entre los grupos (p < 0,05, prueba de Tukey).

La dieta tuvo un efecto principal significativo en BV/TV trabecular, BV, Tb.Th, Tb.N y Tb.Sp (p < 0,05, ANOVA de dos vías, Fig. 3). El ejercicio tuvo un efecto principal significativo en Tb.N y Tb.Sp. Cada grupo con la dieta suplementada tuvo BV/TV trabecular, Tb.N y Tb.Th significativamente mayores y Tb.Sp significativamente más bajos que el grupo de dieta de control sometido a la misma velocidad de ejercicio (p < 0.05, pruebas de Tukey). Todos los grupos con la dieta suplementada tenían BV/TV, BV y Tb.Th significativamente mayores que los valores basales (p < 0,05, pruebas de Tukey). Los ratones no ejercitados con la dieta de control tenían un BV/TV significativamente más bajo que el valor inicial (p < 0,05, pruebas de Tukey). Tanto el ejercicio de baja velocidad como el de alta velocidad impidieron esta disminución.

Arquitectura trabecular tibial izquierda proximal (media ± DE, n = 20/grupo). La dieta tuvo un efecto principal significativo en todas las propiedades medidas, excepto en la densidad mineral tisular (TMD), el aumento del volumen óseo trabecular (BV), el volumen óseo/volumen total (BV/TV), el número trabecular (Tb.N) y el espesor trabecular (Tb. .Th) y separación trabecular decreciente (Tb.Sp). Para los ratones alimentados con la dieta de control, ambas velocidades de ejercicio impidieron una disminución significativa en BV/TV desde el inicio. #Efecto de la dieta significativo (p < 0,05, ANOVA de dos vías). *Efecto significativo del ejercicio (p < 0,05, ANOVA de dos vías). ^Significativamente diferente del valor inicial (p < 0,05, prueba de Tukey). La barra horizontal representa la diferencia significativa entre los grupos (p < 0,05, prueba de Tukey).

A nivel estructural (hueso completo), la dieta tuvo un efecto principal significativo en la fuerza de fluencia después de treinta días (p < 0,05, ANOVA de dos vías, Fig. 4). Los ratones que se ejercitaron a baja velocidad con la dieta suplementada tuvieron una fuerza de rendimiento y un trabajo previo al rendimiento significativamente mayores que el valor inicial (p < 0,05, pruebas de Tukey), y los ratones sin ejercicio con la dieta suplementada tuvieron una fuerza de rendimiento significativamente mayor que el valor inicial. No hubo efectos principales significativos del ejercicio o diferencias significativas entre los grupos para ninguna propiedad mecánica a nivel estructural. A nivel de tejido, el ejercicio tuvo un efecto principal significativo sobre el estrés final después de treinta días (p < 0.05, ANOVA de dos vías, Fig. 5). Los ratones no ejercitados en la dieta suplementada tenían un estrés de rendimiento y un estrés final significativamente mayores que la línea de base (p < 0,05, pruebas de Tukey). No hubo efectos principales significativos de la dieta sobre las propiedades mecánicas a nivel de tejido.

Propiedades mecánicas de la tibia izquierda a nivel estructural (media ± DE, n = 20/grupo). Hubo un efecto principal significativo de la dieta sobre la fuerza de rendimiento, y los ratones que no hicieron ejercicio con la dieta suplementada y los ratones que se ejercitaron a baja velocidad con la dieta suplementada tuvieron una fuerza de rendimiento significativamente mayor que la línea de base. #Efecto de la dieta significativo (p < 0,05, ANOVA de dos vías). ^Significativamente diferente del valor inicial (p < 0,05, prueba de Tukey).

Propiedades mecánicas de la tibia izquierda a nivel de tejido (media ± DE, n = 20/grupo). El ejercicio tuvo un efecto principal significativo sobre el estrés final, disminuyendo la fuerza ósea. El estrés de rendimiento y el estrés final fueron significativamente mayores que la línea de base en ratones no ejercitados alimentados con la dieta suplementada. *Efecto significativo del ejercicio (p < 0,05, ANOVA de dos vías). ^Significativamente diferente del valor inicial (p < 0,05, prueba de Tukey).

Hubo un efecto principal significativo de la dieta en el día 9 y el día 30 Ca sérico (p < 0,05, ANOVA de dos vías, Fig. 6). Hubo un efecto principal significativo del ejercicio sobre el Ca sérico solo el día 30. Para los ratones con la dieta de control, el ejercicio de alta velocidad aumentó significativamente el Ca sérico el día 30 (p < 0,05, prueba de Tukey). Para los ratones con la dieta suplementada, no hubo efectos significativos del ejercicio sobre el Ca sérico. No hubo efectos significativos de la dieta o el ejercicio sobre la P sérica en el día 9. En el día 30, hubo una interacción significativa entre la dieta y el ejercicio en la P sérica. suero P que todos los otros grupos.

Promedio de [Ca] y [P] en suero en los días -4, 9 y 30, n = 20/grupo. Barras de error eliminadas para mayor claridad. La dieta suplementada aumentó significativamente el Ca sérico los días 9 y 30. El ejercicio solo aumentó significativamente el Ca sérico el día 30. La dieta y el ejercicio tuvieron un efecto interactivo significativo sobre la P sérica el día 30. #Efecto significativo de la dieta ese día (p < 0,05, ANOVA de dos vías). *Efecto significativo del ejercicio ese día (p < 0,05, ANOVA de dos vías). &Interacción significativa de la dieta y el ejercicio ese día (p < 0,05, ANOVA de dos vías).

El ejercicio tuvo efectos principales significativos sobre la CTX sérica y la relación PINP/CTX en el día 9 (p < 0,05, ANOVA de dos vías, Fig. 7). Los ratones con la dieta de control sometidos a ejercicio de baja y alta velocidad tuvieron un CTX del día 9 significativamente más alto que los ratones sin ejercicio con la dieta de control (p < 0,05, prueba de Tukey). No hubo efectos principales significativos de la dieta, lo que sugiere que el ejercicio tuvo un mayor impacto en el metabolismo óseo que la dieta en el día 9. Hubo efectos principales significativos del ejercicio en el CTX sérico y PINP en el día 30, y hubo un efecto principal significativo de la dieta en el suero. CTX en el día 30. En el día 30, los ratones que se ejercitaron a alta velocidad con la dieta suplementada tenían una proporción sérica de PINP/CTX significativamente más baja que los ratones sin ejercicio con la dieta suplementada.

CTX y PINP séricos (media ± DE, n = 7/grupo) el día 9 y el día 30. Para los ratones con la dieta de control, el ejercicio disminuyó significativamente el PINP/CTX el día 9, lo que provocó un estado del metabolismo óseo menos favorable a la formación. De manera similar, para los ratones con la dieta suplementada, el ejercicio disminuyó significativamente PINP/CTX en el día 30. #Efecto significativo de la dieta (p < 0,05, ANOVA de dos vías). *Efecto significativo del ejercicio (p < 0,05, ANOVA de dos vías). &Interacción significativa de la dieta y el ejercicio ese día (p < 0,05, ANOVA de dos vías). La barra horizontal representa la diferencia significativa entre los grupos (p < 0,05, prueba de Tukey).

Después de treinta días de intervenciones, la dieta tuvo un mayor impacto sobre la masa y la fuerza ósea que el ejercicio (figs. 2, 3 y 4). El régimen de dieta y ejercicio en este estudio (4 semanas, 20 minutos de ejercicio por día) resultó en efectos similares sobre la masa ósea tibial y la fuerza que los estudios previos que involucraron duraciones más largas de ejercicio (8 semanas, 30 minutos de ejercicio por día)2,5 . La carga tibial directa en roedores ha disminuido la efectividad cuando se aplica una gran cantidad de ciclos de carga por día, pero la cantidad de ciclos de carga utilizada aquí fue un orden de magnitud mayor26. Por lo tanto, no es probable que las duraciones más largas de ejercicio en la caminadora sean más beneficiosas para la salud ósea.

Las intervenciones de dieta y ejercicio tuvieron un mayor impacto en el hueso trabecular tibial. Este estudio mostró, por primera vez, que esta dieta suplementada aumenta el volumen del hueso trabecular en la tibia proximal (Fig. 3B). El aumento de BV/TV, pero no de CtAr/TtAr, área cortical o TMD en ratones con la dieta suplementada puede ser una señal de que este programa de dieta y ejercicio a corto plazo fue más efectivo en el hueso trabecular. La respuesta del hueso a estímulos mecánicos y de otro tipo puede ser específica del sitio27. Podrían producirse cambios en el hueso trabecular, pero no en el cortical, después de una intervención breve, ya que la tasa metabólica del hueso trabecular puede ser mayor que la del hueso cortical. El ejercicio a largo plazo durante 8 semanas aumenta el área cortical2, y el programa de ejercicios de alta velocidad utilizado aquí también puede haber aumentado el área cortical si se aumentó la duración del programa de ejercicios.

Hubo una disminución en BV/TV trabecular con la edad de 15 a 19 semanas en ratones de control. Para los ratones con la dieta de control, el ejercicio previno esta disminución relacionada con la edad en BV/TV trabecular. Dado que el ejercicio parecía no tener ningún efecto en los ratones con la dieta suplementada, mientras que brindaba algunos beneficios a los ratones con la dieta de control, los efectos del ejercicio pueden depender del suministro de minerales en la dieta. El ejercicio parece ser más impactante cuando el suministro de minerales en la dieta es insuficiente.

El ejercicio de alta velocidad redujo significativamente el peso corporal al final del estudio (Fig. 1). Los ratones en los grupos de ejercicio de alta velocidad no tenían menor masa ósea tibial o fuerza mecánica, como cabría esperar con una disminución del peso corporal28,29. La normalización de la masa ósea y la fuerza por el peso corporal no reveló ninguna información adicional, ya que ninguna propiedad normalizada del peso corporal se vio afectada significativamente por el ejercicio (datos no mostrados). Por lo tanto, el programa de ejercicio de alta velocidad permitió a los ratones alcanzar la misma masa ósea y fuerza con un peso corporal más bajo en comparación con los ratones sin ejercicio.

La dieta suplementada causó un Ca sérico significativamente mayor que la dieta de control en el día 9 y el día 30 (Fig. 6A). El mayor suministro sérico de Ca de la dieta suplementada finalmente podría haber conducido a una mayor BV/TV trabecular después de treinta días. Dado que el ejercicio solo afectó el Ca sérico al final del estudio, aumentar la duración del programa de ejercicio podría conducir a mayores aumentos en BV/TV trabecular en ratones ejercitados con la dieta estándar.

Los ratones que se ejercitaron a velocidades altas y bajas mientras se alimentaban con la dieta suplementada tenían fósforo sérico significativamente más bajo el día 30 que los ratones que no hacían ejercicio y los ratones que se ejercitaban mientras se alimentaban con la dieta de control (Fig. 6B). Los roedores sometidos a ejercicio en cinta rodante pueden tener una mayor demanda de fósforo y calcio30. Aunque la dieta suplementada tiene el doble de fósforo que la dieta de control, esta concentración aún puede no ser suficiente para las mayores demandas de minerales del ejercicio. El ejercicio no disminuyó el fósforo sérico en los ratones con la dieta de control, posiblemente debido a la menor relación Ca:P en la dieta de control. La relación Ca:P elevada en la dieta suplementada puede ser beneficiosa para el calcio sérico, pero perjudicial para el fósforo sérico. Los ratones no se asignaron a grupos de fósforo sérico basal equivalente. Las diferencias iniciales en el fósforo sérico pueden haber sido un factor en las diferencias significativas entre los grupos observadas el día 30, aunque solo los ratones ejercitados con la dieta suplementada tuvieron una disminución en el fósforo sérico del día 9 al día 30.

En el día 9, hubo un efecto principal significativo del ejercicio sobre la relación PINP/CTX (Fig. 7C). Se esperaría que este cambio en el metabolismo óseo condujera a una disminución de la formación ósea. Similar a la reducción en PINP después de un día de ejercicio2, un PINP/CTX más bajo en el día 9 sugiere que el ejercicio podría estar limitando el crecimiento óseo durante más de una semana después del inicio del programa de ejercicios. Esta disminución en el crecimiento es transitoria, ya que no hay diferencias significativas en el área cortical y el volumen del hueso trabecular en ratones ejercitados después de treinta días (Figs. 2B y 3B). Para los ratones con la dieta suplementada, el día 30, el ejercicio de alta velocidad disminuyó significativamente la relación PINP/CTX (Fig. 7C). Los ratones que se ejercitan mientras siguen la dieta suplementada pueden estar alcanzando el pico de masa ósea a un ritmo más rápido que los ratones que no se ejercitan con la misma dieta. Esto conduciría a una disminución en la relación PINP/CTX como se vio en este estudio.

No hubo un efecto significativo de la velocidad del ejercicio sobre las mediciones morfológicas o mecánicas del hueso cortical o trabecular. El aumento de la velocidad de la cinta de correr puede no tener un impacto en el hueso si no conduce a mayores cargas máximas. El ejercicio de alta velocidad condujo a una mayor frecuencia de carga promedio, pero puede que no haya sido un cambio lo suficientemente grande como para tener un efecto. En el modelo de carga tibial directa, el aumento de la frecuencia de carga se asocia con una mayor tasa de formación de hueso21. La tasa de formación ósea no se midió directamente aquí, pero los marcadores del metabolismo óseo CTX, PINP y PINP/CTX pueden sufrir cambios que son indicativos de una mayor formación ósea2,31,32.

Hubo algunas limitaciones en este estudio. No pudimos medir la magnitud de la tensión máxima aplicada a los huesos durante el ejercicio. Por lo tanto, no pudimos determinar si el aumento de la velocidad de la cinta rodante condujo a una mayor magnitud de tensión en los huesos. Sin embargo, medimos una mayor tasa de pasos del ratón a la mayor velocidad de ejercicio, lo que indica que probablemente se estaba aplicando un aumento en la tasa de tensión a los huesos. Para comparar con el trabajo anterior, solo se usaron ratones macho adultos C57BL/6. Por lo tanto, no sabemos si la edad, el sexo y/o la tensión del ratón afectan los resultados de estas intervenciones de dieta y ejercicio. El trabajo futuro podría examinar los efectos de estas intervenciones en diferentes poblaciones de ratones con diferentes duraciones de dieta y ejercicio. Además, no se midieron el consumo de alimentos ni los niveles de actividad de la jaula del ratón, por lo que no se sabe si la pérdida de peso corporal se debe al aumento de la actividad oa la disminución del consumo de alimentos. Los ratones que corren a velocidades similares a nuestro ejercicio en cinta rodante de alta velocidad pueden tener un consumo de alimentos reducido33,34. Es posible que los ratones ejercitados a alta velocidad hayan disminuido el consumo de alimentos, lo que resultó en una disminución del peso corporal. Sin embargo, todas las mediciones de masa y fuerza ósea indicaron que la masa y la fuerza ósea aumentaron y se mantuvieron, respectivamente. Por lo tanto, parece que todos los ratones que se ejercitaron a alta velocidad recibieron suficiente ingesta de nutrientes para la salud ósea. Este estudio se realizó en ratones que corren a cuatro patas. Los resultados pueden variar en humanos que corren sobre dos piernas y pueden tener una distribución diferente de la carga sobre los huesos durante la carrera.

Después de treinta días de ejercicio en cinta rodante de alta velocidad, los ratones tenían un peso corporal más bajo, independientemente del suministro de minerales en la dieta. Estos cambios en el peso no se produjeron a expensas de la masa ósea cortical tibial, el volumen del hueso trabecular o las propiedades mecánicas. Los ratones que se ejercitaron a alta velocidad con la dieta suplementada tuvieron el mayor CtAr/TtAr, área cortical y BV/TV trabecular después de treinta días. Juntos, estos cambios en las propiedades óseas y el peso corporal sugieren que combinar un programa de ejercicio de alta velocidad con una dieta suplementada con minerales podría ser lo mejor para maximizar la masa ósea y la fuerza para prevenir fracturas óseas en humanos, junto con los beneficios adicionales para la salud de la pérdida de peso. Estos resultados podrían conducir al diseño de intervenciones de dieta y ejercicio para la pérdida de peso sin efectos perjudiciales para la salud ósea.

Todos los procedimientos con animales se realizaron con la aprobación del Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Michigan (protocolo n.º 00005237) y cumplieron con las pautas y regulaciones pertinentes. Este estudio se informa de acuerdo con las pautas ARRIVE. Ciento treinta y ocho ratones C57BL/6 macho, 26,3 ± 2,8 g de peso corporal medio, se adquirieron de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) a las 13 semanas de edad. Los ratones se alojaron individualmente y se alimentaron con la dieta de control durante 2 semanas de aclimatación. El día 1, a las 15 semanas de edad, los ratones fueron asignados a uno de 7 grupos: (1) un grupo de referencia sacrificado el día 1, (2) un grupo sin ejercicio alimentado con la dieta de control, (3) un grupo sin ejercicio grupo alimentado con la dieta suplementada, (4) un grupo de ejercicio de baja velocidad alimentado con la dieta de control, (5) un grupo de ejercicio de baja velocidad alimentado con la dieta suplementada, (6) un grupo de ejercicio de alta velocidad alimentado con la dieta de control, y ( 7) un grupo de ejercicio de alta velocidad alimentado con la dieta suplementada. Los ratones se dividieron en grupos de igual peso corporal medio y concentración sérica basal de Ca. El Ca sérico de referencia se midió 5 días antes del día 1 del experimento (día -4). Después de 30 días de tratamiento, los ratones de todos los grupos experimentales se sacrificaron a las 19 semanas de edad y se recogieron las tibias izquierdas para su análisis.

Las formulaciones de la dieta fueron las mismas que hemos utilizado anteriormente2,5. La dieta de control fue una dieta AIN-93G (TestDiet®, Richmond, IN) que se modificó agregando fosfato dicálcico para que contuviera 0,5 % de Ca y 0,5 % de P. En la dieta suplementada, se agregaron fosfato dicálcico y carbonato de calcio para dar a la dieta 5 % de Ca y 1 % de P. Las cantidades de minerales en la dieta y la relación Ca:P se diseñaron para aumentar el Ca sérico aumentando la absorción pasiva de Ca en los intestinos2,5,35,36,37. Para la dieta de control, el alimento tenía 3,90 kcal/g y la distribución de calorías era de 65,0% de carbohidratos, 16,3% de grasas y 18,7% de proteínas, mientras que la dieta suplementada tenía 3,39 kcal/g con la misma distribución de calorías. Todos los demás nutrientes fueron equivalentes entre las dietas.

Todos los ejercicios se realizaron en una cinta rodante durante las horas de luz (Columbus Instruments, Modelo 1055 M, Columbus, OH). Los carriles de la cinta rodante estaban cubiertos de tal manera que los carriles en movimiento estaban en la oscuridad, y si los ratones se caían de la cinta rodante, estarían a la luz. Esto proporcionó motivación para permanecer en la cinta de correr. El programa de ejercicios de baja velocidad consistió en correr en una cinta rodante con una inclinación de 5° a 12 m/min, 20 min/día durante 30 días consecutivos. Los ratones se incrementaron gradualmente hasta una velocidad máxima de 12 m/min en los primeros 3 días de ejercicio. El programa de ejercicios de alta velocidad consistió en correr en una cinta rodante con una inclinación de 5° a 20 m/min, 20 min/día. Los ratones se incrementaron gradualmente hasta una velocidad máxima de 20 m/min en los primeros 8 días de ejercicio. Esta velocidad era la velocidad máxima que los ratones podían mantener corriendo durante 20 minutos sin caerse de la cinta de correr en esta inclinación y es similar a la velocidad máxima a la que los ratones pueden correr38. El cumplimiento del ejercicio se mantuvo golpeando las colas de los ratones que se caían de la caminadora durante el ejercicio. El análisis de video cuadro por cuadro de ratones corriendo arrojó una frecuencia promedio estimada de 3,4 pasos/segundo en ratones corriendo 12 m/min y 4,2 pasos/segundo en ratones corriendo 20 m/min. Según estas estimaciones, los ratones dieron un promedio de 4080 y 5040 pasos por sesión de ejercicio a velocidades de 12 m/min y 20 m/min, respectivamente. Por lo tanto, el programa de ejercicios de alta velocidad tuvo una mayor frecuencia de carga, y ambos programas de ejercicios ofrecieron una cantidad suficiente de ciclos de carga/día para tener un efecto en el hueso de modo que cualquier duración adicional probablemente no produciría cambios adicionales en el hueso26.

Las mediciones de micro-CT de hueso cortical y trabecular se obtuvieron como hemos detallado5. Se incluyeron tibias completas en agarosa y se escanearon con un escáner de muestras micro-CT (µCT100 Scanco Medical, Bassersdorf, Suiza). Los ajustes de exploración fueron tamaño de vóxel de 12 μm, 70 kVp, 114 μA, filtro AL de 0,5 mm y tiempo de integración de 500 ms. Los escaneos se analizaron utilizando algoritmos en el software Scanco IPL. Para la medición de métricas de geometría cortical: fracción de área cortical (Ct.Ar/Tt.Ar), área cortical (Ct.Ar), área transversal total, grosor cortical (Ct.Th) y densidad mineral tisular volumétrica (TMD) , se eligió una sección transversal de 180 μm de espesor de un sitio estándar ubicado al 21,7% de la distancia desde la unión tibia-peroné hasta el extremo proximal de la tibia. La sección de hueso cortical está ubicada aproximadamente en el centro de la región de prueba mecánica de flexión de cuatro puntos. Se analizó una sección transversal separada de 180 μm de espesor en el sitio de la fractura para las mediciones de la geometría cortical utilizadas en los cálculos de las propiedades mecánicas a nivel de tejido (momento de inercia, distancia desde el eje neutral). También se analizaron exploraciones tibiales para las propiedades del hueso trabecular. Las secciones metafisarias tibiales proximales de 480 μm de espesor inmediatamente debajo de la placa de crecimiento se analizaron utilizando volúmenes de interés trazados a mano alzada. Las propiedades trabeculares medidas fueron fracción de volumen óseo (BV/TV), volumen óseo (BV), número trabecular (Tb.N), grosor trabecular (Tb.Th), separación trabecular (Tb.Sp) y TMD.

Las propiedades mecánicas a nivel estructural y tisular se midieron en todos los grupos como hemos descrito anteriormente2,5. Las propiedades a nivel estructural (fuerza, deformación, rigidez, trabajo) se midieron a partir de una prueba de flexión de 4 puntos hasta el fallo (tramos interiores de 3 mm y exteriores de 9 mm). Las tibias se cargaron hasta el fallo con el lado medial de la mitad de la diáfisis en tensión bajo control de desplazamiento a 0,025 mm/s con una frecuencia de muestreo de datos de 30 Hz. Las propiedades mecánicas a nivel de tejido (esfuerzo, deformación, módulo, tenacidad) se estimaron utilizando la teoría de flexión del haz con medidas geométricas (momento de inercia sobre el eje anteroposterior, distancia desde el centroide hasta el lado medial del hueso) a partir de datos de micro-CT en el sitio de fractura39.

Las muestras de sangre en ayunas tomadas antes del ejercicio diario se recogieron por sangrado de la vena submandibular como hemos descrito2. Los ratones ayunaron al comienzo de las horas de luz y se recolectó sangre seis horas después. Se recogieron muestras de sangre el día -4 (línea de base), el día 9 (después del primer día de carrera a toda velocidad para todos los grupos de ejercicio) y el día 30 (el último día de ejercicio). Nuestro trabajo anterior mostró cambios significativos en los marcadores del metabolismo óseo en suero después de un día de ejercicio, pero no se mantienen a largo plazo2. Por lo tanto, el suero se examinó en las primeras etapas del estudio, justo después de que los ratones ejercitados a alta velocidad comenzaran a correr a toda velocidad durante toda la sesión de ejercicio. El suero se aisló por centrifugación. Las concentraciones de calcio y fósforo se midieron en todos los puntos de tiempo utilizando el kit de prueba Calcium CPC LiquiColor (Stanbio Laboratory, Boerne, TX) y el kit Phosphorus Liqui-UV (Stanbio Laboratory). Se usaron ELISA para medir los marcadores de formación y resorción ósea (péptido amino-terminal (PINP) pro-colágeno tipo I y enlaces cruzados de colágeno carboxi-terminal (CTX) (Immunodiagnostic Systems, Inc., Scottsdale, AZ)) en muestras del día 9 y el día 30. Se siguieron todas las instrucciones del kit de los fabricantes, incluido el uso de los estándares proporcionados para obtener las curvas estándar.

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Graphpad Prism. Se verificó la normalidad de los datos mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Las mediciones de la geometría cortical, las mediciones de la arquitectura trabecular, las propiedades mecánicas y los biomarcadores séricos se analizaron mediante ANOVA de dos vías con pruebas post-hoc de Tukey para determinar si los efectos individuales de la dieta o el ejercicio eran significativos (p < 0,05) y si los tratamientos combinados tenían un efecto interactivo significativo. Se usaron ANOVA de una vía con pruebas post-hoc de Tukey para comparar la línea de base con los grupos experimentales. Los datos que fallaron la prueba de normalidad se probaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis con las pruebas post-hoc de Dunn. Los valores atípicos se eliminaron mediante la función ROUT de GraphPad para detectar valores atípicos mediante regresión no lineal40.

Todos los datos se publican en las figuras del manuscrito y en los archivos complementarios.

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Este trabajo fue apoyado por el premio NIH R01-AR052010 y el National GEM Consortium Ph.D. Beca de Ingeniería. Gracias a Michelle Lynch y al núcleo MicroCT de la Facultad de Odontología de la Universidad de Michigan, financiado en parte por NIH/NCRR S10RR026475-01. También quisiera agradecer a Erin McNerny y Joe Gardinier por su orientación y asistencia.

La Universidad de Michigan, 1011 N University Ave., Ann Arbor, MI, 48109, EE. UU.

Michael A. Friedman y David H. Kohn

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MAF y DHK fueron responsables de la concepción del experimento, el diseño del experimento, el análisis y la interpretación de datos y la edición del manuscrito. MAF fue responsable de la recopilación de datos y redacción del manuscrito.

Correspondencia a David H. Kohn.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Friedman, MA, Kohn, DH La dieta suplementada con calcio y fósforo aumenta el volumen óseo después de treinta días de ejercicio en cinta rodante de alta velocidad en ratones adultos. Informe científico 12, 14616 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-19016-8

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Recibido: 10 de marzo de 2022

Aceptado: 23 de agosto de 2022

Publicado: 26 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-19016-8

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